將SDS-PAGE 的gel 轉漬到membrane上 , 再利用一次和二次抗體標定,使其呈色,觀察蛋白質的表現

結果:

討論

• 轉漬蛋白質需要相當久的時間,在進行轉漬時要注意濾紙和粗棉`細棉之間儘可能不要留下氣泡,否則對實驗會有不好的影響,可能就會transfer1不完全
• 使用二級抗體可以有放大訊號的效果,現在大多向生技公司採購
• 呈色在membrane上因為用數位相機拍的相當模糊,所以我拿去掃描,結果發現顏色幾乎快看不見了,還好剛做完得時候有做記號
• 用Western analyis定量並不容易,需要用的呈色物質必須再作用之前可溶,但作用之後,變成不可溶,一開始可溶才能均勻的分佈去做呈色,但呈色後又不能是可溶的,不然所呈色的部份又擴散開來了.而一般來說定量會利用ELISA,以讀取吸光值來測定含量,此時所用的呈色物質就必須在作用前後都是可溶的,以免分佈不均勻,但ELISA的專一性比Western analyis 差
• 我們所用的是5% blocking buffer (脫脂奶溶於PBS),除此之外,也可以用gelatin or BSA,一般多用mlk,成本較低,但若sample中有與milk相關的成分要去detect,則就不適合使用milk做blocking.