Abstract
本實驗主要是利用酵母菌(Pichia pastoris)來進行細胞激素(cytokine)的生產，實驗分為二個部分，第一部份是要構築兩個質體DNA(pPICZαA/scmIL-12，pPICZαA/mIL-18)，再將這兩個質體DNA分別轉殖送入Pichia pastoris細胞中，作為日後表現蛋白用。第二個部分是要利用帶有質體pPICZαA/hIL-2的酵母菌轉殖株，進行蛋白誘導表現，生產human IL-2。
Introduction
在癌症的免疫治療中，利用細胞激素(cytokine)與單株抗體(monoclonal antibody)所生成的複合蛋白(fusion protein)，可產生較佳的抗癌效果。其原理是利用單株抗體對癌細胞之專一性，有效地將複合蛋白與癌細胞結合，複合蛋白上之細胞激素能吸引並活化白血球至癌細胞周圍，發揮抗癌的效果。在先前的實驗中，我們已經得知IL-2複合蛋白在小鼠模型中，具有治療Ｂ型淋巴瘤的效果，IL-4與GM-CSF亦有不錯之抗癌能力。本實驗便是要利用酵母菌(Pichia pastoris)來進行細胞激素的生產，以提供動物實驗中所需之大量細胞激素。
Pichia pastoris相對於原核生物的表現系統，外來蛋白在Pichia pastoris內表現，其糖基化作用與哺乳動物細胞轉譯後修飾作用(posttranslational modification)的能力相仿，使蛋白更接近原本在生物體內之型態，除了轉譯後修飾作用外，Pichia pastoris更保有大腸桿菌系統之優點，如：高產量、生長快速、操作容易、成本低廉等。Pichia pastoris是一種methylotrophic的酵母菌，可在只有甲醇的環境下，以甲醇作為唯一碳源進行代謝作用並產生能量。代謝過程中需用到alcohol oxidase將甲醇氧化成甲醛，在Pichia pastoris中有兩個基因負責alcohol oxidase的蛋白表現，分別是AOX1及AOX2，其中以AOX1為主，AOX2基因雖然與AOX1有97%的相似性，但其表現出的alcohol oxidase代謝甲醇產生能量的能力卻比AOX1差。所以當酵母菌的AOX1基因有缺陷時，在甲醇培養基中會有生長緩慢的現象，此表現型稱為Muts，而AOX1基因正常者，稱此表現型為Mut+ 。AOX1基因的調控是相當嚴格，需有甲醇誘導下才會被啟動，因此我們可以將外來蛋白基因插在AOX1基因前面，如此便可在甲醇的誘導下大量表現外來蛋白。
在這次實驗中我們cloning所選用的vector(pPICZαA)，可使外來蛋白表現後，被分泌至細胞外，方便蛋白質的收取。此外pPICZαA具有Zeocin resistance gene，可作為大腸桿菌或酵母菌進行positive selection用。