一、    研究動機與研究問題

1993年Begun和Aquadro發現從Zimbabwe採集的黃果蠅（D. melanogaster）種，和北美地區的黃果蠅在DNA層次上有很大的差異；Wu et al. （1995）隨後研究發現Zimbabwe採集的D. melanogaster與鄰近地區的同種果蠅有明顯的單向生殖隔離（sexual isolation）；研究指出，即使為同種，別處採集的雄性果蠅，不會與在Zimbabwe採集的雌性果蠅交配。

一向以來，我們一直認為物種分化的演化模型，通常是藉由地理隔離來造成同種族群間基因變異的累積，當累積到一定的程度時，該種處於兩地的族群便會產生生殖隔離，從而達到我們一般定義的新物種形成。但是這個模型的證明，卻面臨一個很大的問題：基因變異的累積過程，許多的事件或動態上的資訊，會在種化完成後在基因資料中被遺失掉；而這也造成在已經形成的物種間研究種化的分子演化時一個很大的障礙，從而科學家開始試圖以這個模型去定義處於「種化階段的物種（incipient speciation）」與尋找這樣狀態的物種，作為研究的材料。根據這樣的定義，生殖隔離的形成，代表雙方的遺傳物資無法經由交配而混和，以及流通到雙方各自的族群基因庫（gene pool）中；因此，不是雙方的個體間無法交配或生育下一代，就是雙方雜交後產生的下一代沒有生育能力（sterile）。

由於黃果蠅是一種分布廣泛的類種，與其他果蠅種間的生殖隔離非常完全。Zimbabwe發現的黃果蠅咸被相信正處於從該物種分化出新種的階段中，且由後續的許多研究指出分子層次的生殖隔離佔重要的地位（Hollocher et al., 1997）。由於這個研究也間接的支持雌性選配的生殖隔離理論（female choice of sexual isolation），因此後續的研究也著重在兩地的黃果蠅間的體染色體與X染色體上，並已經發現了染色體層次上不少的決定區域，有利於發現此種分化的決定基因、乃至於果蠅性行為基因層次研究的突破（Ting et al., 2001）。不過Johnson and Palopoli研究指出Y 染色體並沒有在這生殖隔離中扮演重要的地位。

果蠅的Y染色體，因為其染色體結構的關係，本身就具有基因研究上的困難。研究指出在果蠅，不同於哺乳動物，決定性別的基因並不是在Y 染色體上；但是Y 染色體上仍然被證明其存在與否決定了雄性果蠅的生殖力（Bridges 1916），並且也有新近發現相關的基因提供證據（Gepner and Hays, 1993）。

fig. 1. 圖示黃果蠅在北美品種與Zimbabwe品種的生殖隔離。

由於兩地的黃果蠅之間，生殖隔離並不是非常的完全，所以兩者之間的基因仍然有互相流通的可能性。不過，即使在Y染色體上面，應該並沒有對這個新種分化有重要影響的基因存在，由於Y染色體並不容易與X染色體等其他染色體互換，我們做了一個假設：在Zimbabwe與其他地方採集的黃果蠅，Y染色體上的遺傳變異會比較容易累積，而不

會在雜交時的基因流動中互相交換而稀釋掉了彼此的變異差異。由於果蠅Y 染色體上有大量的異染色質（heterochromatins），有意義的序列變異研究必須在基因上著手。A. B. Carvalho的團隊，在2000與2001年時，運用新的想法與技術，在果蠅的Y 染色體上發現了因許多過去技術上的瓶頸而無法定位的九個蛋白質基因（protein coding gene）。我們計劃選取新近發現在Y染色體上的PPr-Y與ORY兩個基因的序列比對，來研究Zimbabwe和其他地區黃果蠅族群間的基因變異。

PPr-Y（protein phosphatase 1 regulatory subunit）經Carvalho的研究，發現其為大約1.7kb大小的基因，裡頭並含有一段intron；RT-PCR的定序則是約1.2kb的exon。不過此一exon卻在alternative splicing中會有兩種產物，分別是較小（223 residues）與較大（569 residues）的兩個蛋白質；序列分析證明整段exon的前端、構成較小蛋白質的部分，相似於酵母菌的Sds22p基因。兩者主要都發現有leucine-rich repeat。Sds22p已經證實是dynein light chain的一部分，有關於dynein light chain的一些signal transduction pathways與其和heavy chain上motor domain結合的作用。PPr-Y的後段基因，Carcalho在序列分析上找不到與其有相似的基因或片段，不過並無法證實這一後段的基因、乃至於splicing後的較大蛋白質產物，是沒有功能性的。因此，我們準備將PPr-Y整段約1.2kb的基因都選取為研究比較的對象，並希望可能可以以此研究後段基因是否有功能性存在。

ORY（Occludin-related Y）是坐落在ks-1區域的基因，序列上充斥著coiled-coiled motifs，一般認為具有蛋白質間作用的一種功能區；也因此，序列比對上與ORY相似的基因很多，不容易藉由序列的對比推測其功能；Carcalho則發現了此一基因與老鼠的一個相關雄性生殖力的膜蛋白occludin/ELL domain與兩者蛋白質表現的相似性，因此認為ORY可能在功能上也與occludin有關。我們也希望可能可以從序列比對中，找出ORY基因結構上可能提供的演化與功能線索。

以此兩基因為基礎，配合其他現有在體染色體與X染色體上已知的基因序列，我們希望可以從黃果蠅與其Zimbabwe採集種，以及選取其他種的果蠅（D. simulans, D. mauritiana），作序列變異的研究，以觀察在種間、和處於生殖隔離的分種狀態下的果蠅間，在Y染色體、X 染色體或體染色體上，基因序列上突變保存程度和生殖隔離的關係，提供在演化時基因突變動態上的一些資訊與線索；以及基因結構上的額外比對，可能可以提供這些基因一些分子演化上功能的發現與進一步研究。

二、        研究方法及步驟

A.     PPr-Y基因的定序

單隻果蠅成體為樣本，於1.5ml微量離心管中磨碎，已60μl protease solution（0.1 M Tris-HCl pH8.0, 0.05M EDTA, 0.2M NaCl, 1% SDS, 0.4mg protease K/ml），65℃水浴三分鐘後以石碳酸及氯仿溶液萃取。以兩倍體積酒精加入、70℃三十分鐘靜置沉澱DNA，離心後以70%酒精沖洗、抽乾，至於50~100μl蒸餾水中。（Bechenbach et al., 1993）

PPr-Y的基因定序，我們準備以資料庫上可以取得的序列資料，設計三段primers，一段在基因的5’端上，兩段在中間，以PCR作DNA交叉定序，提高鑑別率。

1.      聚合式連鎖反應 （PCR）

以一對引子增福DNA：0.5ml薄壁離心管中，10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCL、1.5mM MgCl2­­­­­的混合溶液取50μl裝入，每一萃得之2μl DNA樣品加入1mM的dNTP、1μl引子與 Taq polymerase 2.5 unit，於溫度循環器中進行循環；每循環包括94℃ 行50秒 denaturation、55℃行2分鐘的 annealing及72℃ 1分鐘的extension，三十循環後作72℃ 10分鐘的final extension。用­­­­­­Amplify 2.5和Oligo 4.0 確認；用1% agarose跑膠及5×10-5%溴化乙碇染色與紫外光呈像。

2.      產物純化

將DNA產物加入100~300μl direct isolated buffer與1ml PCR Preps resin，震盪20秒後接minicolumn 至 vacuum manifold抽氣過濾，2ml 80%異丙醇抽濾洗minicolumn，移走注射針筒後將minicolumn接上離心管上以12krpm離心20秒清除殘餘異丙醇，minicolumn換至新離心管加入50μl去離子水或TE緩衝液，靜置一分鐘，再以12krpm離心20秒分離DNA至離心管中，以-20℃狀態保存。

3.      基因定序

每一管反應物加入DNA Polyerase、FS酵素或 dRhod termination RR mix 4μl、DNA模板（PCR產物）、3.2μ引子（50ng/μl）、用離子水加到10μl，在溫度循環器中進行：95℃ 2分鐘、94℃ 30秒、56℃ 30秒、60℃ 4分鐘的循環，並重複後三個步驟到三十個循環後停於4℃直到取出為止。取出產物加入每管40μl去離子水、7.5μl 2M醋酸鈉（pH 5.2）、125μl 100%酒精後置於-70℃ 三十分鐘。以13~16krpm離心機中離心15分鐘後吸出溶液，以200μl 70%酒精清洗沉澱，吸出酒精後真空抽乾10分鐘。用deionized formamide 與含50ng/μl blue dextran的25nM EDTA（pH 8.0）以5：1混和為loading buffer，各管加入4μl，混和反應後快速離心，至於95℃ dry bath中2分鐘後置於冰上至loading為止，取2μl作loading。

定序用膠片用250ml去離子水中加入19g acrylamide與1g bis-acrylamide、250g 尿素及0.5g amberlite beads，在70℃水浴中溶解藥品，先後過濾50ml 10×TBE與前述之溶液，加水到500ml，室溫冷卻後存於4℃冰箱。取30ml 溶液與54μl 25% ammonium persulfate、18μl TEMED均勻混和後小心上膠，齒磨插入後平置膠架並覆上大張Kimwipes以防落塵。膠架放入定序儀後安裝完畢，上下chamber各加入625ml 1×TBS，以注射筒吸液清洗chamber。

預跑一小時後，以2200V跑7小時的膠，可以得到約700-800鹼基的結果。

B.     ORY 基因的定序

ORY由於基因結構上有兩小一大的introns，我們準備用RT-PCR的技術定序；初步是準備設計在5’端上的primer作萃取與定序。

果蠅群50隻成體經均質化（homogenize）後放在500μl TRIzol Reagent中，室溫放5分鐘，再加入100μl chloroform，手搖15秒，放在室溫2到3分鐘。用12000g 於冷室離心15分鐘，將上清液取出後用250μl propanal混和上清，至於室溫10分鐘後再離心12000g 10分鐘。沉澱物以500μl 70%酒精沖洗，以10000g 5分鐘離心。沉澱物燥乾1分鐘後以50μl DEPC-water懸浮，儲存在-80℃之狀態下。

1. 反轉錄聚合式連鎖反應 （RT-PCR）

我們是準備以Oligo（dT）進行反轉錄工作：在薄壁離心管中置入5μl左右的RNA、引子、Oligo（dT）12-18（0.5μg/μl）與10mM dNTP mix，在65℃中靜置五分鐘，再冰浴一分鐘。配置混和10×RT buffer 2μl、25mM MgCl2 4μl、0.1M DTT 2μl與RNASEOUT 反轉錄脢抑制劑1μl之溶液加入均勻混和，42℃反應2分鐘。加入1μl的RT，混和後42℃反應50分鐘。然後用70℃處理15分鐘終止反應，再加入1μl Rnase，反應37℃ 20分鐘以分解RNA。

取得之cDNA，作酒精沉澱純化，就可以如A. 1.之步驟直接作聚合式連鎖反應之模板進行增幅。

2. 產物純化

同A. 2.之步驟。

3. 基因定序

同A. 3.之步驟。

三、    預期結果

我們希望可以完成兩個Y染色體上基因的三個物種（D. melanogaster, D. simulans, D. mauritiana）、四個品系的定序，並從比較中分析這些基因在演化上序列突變與基因流通的動態，為物種分化時分子、基因層次上行為表現的研究範例。由於以生殖隔離後的性染色體為背景的分子演化研究並沒有非常顯著的進度，我們也期待從可以立即獲得的體染色體上序列比較中看出Y 染色體上和他們的差異，以支持我們的假設，從而提供以上我們預期可以進行的發展。

預期上，這個實驗最理想的結果，就是可以確定經由先前研究所指出的比對相似的可能功能性序列（functional domain or motif）的保守性，與其它此兩個基因中序列上比起這些保守序列與其他染色體上的基因序列歧異度有相對的較大；而針對不同的歧異現象，我們可以經由不同的進路去思考與分析，並從而檢驗許多動態模型的可能性。

由整個定序與分析的過程，我們也可以對這兩個果蠅Y染色體上的基因作更進一步的研究，包括基因結構和表現情形。雖然預期在這些基因的序列中，發現因分種時基因隔離所造成的基因差異配合上述我們研究是主要的目標，但是我們也期待非預期的結果，也就是在物種與分種中的族群間在這些基因上保守而歧異度小的序列，可能暗示我們這些基因可能未經由基因資料庫比對所發現的功能區（domain）。

目前整個研究計劃由於只包含了果蠅Y染色體的兩個基因，相信所得到的結果與經驗也可以為其他基因的研究奠下基礎。

四、參考文獻

 

1.      Begun, D. and Aquadeo, C. F. （1993） African and North American populations of Drosophila melanogaster are very different at the DNA level.  Nature （London） 365, 548-550

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五、需要教師指導內容

 

技術上，以萃取果蠅的DNA與mRNA是一般的實驗室訓練所不常接觸到的，是個人必須經過老師指導才能理解步驟與執行的實驗步驟。除此之外，整個實驗的技術上都是比較基本的分子生物實驗的技術，相信經過指導老師針對相關的技術面問題給予額外的教導，實驗應該可以順利如期的完成。

而由於我們目前無法預測所得到的基因序列差異比對會是什麼樣型態的結果，故個人必須除了實驗的進行外，要多向指導老師參詳關於各種研究目標、方法、研究材料、與序列結果的一些研究與發表，針對各種不同的背景與所得結果，學習分子演化的基因序列分析的概念與思路，以準備好應付得到的結果，作出最正確的分析與後續動作，將看似構成單純的基因序列比較的資料，擴大出最充實與實用的分析結果，提供這一領域的研究參考。