Procedure

一、ML-14a細胞中HbsAg及IL-10免疫組織化學染色
取轉殖的ML-14a細胞，以cytopine，將細胞打在玻片上，乾燥後以1% formaldehyde固定 1分鐘後，浸泡在phosphate-buffered saline（PBS， pH 7.2）中 3分鐘。以acetone 於4℃ 固定3分鐘，以PBS潤濕之後，置入3% H2O2 5分鐘，再浸泡在PBS中3分鐘，即加入anti-small HbsAg 或anti-IL-10的第一抗體，室溫作用一小時。以PBS 洗去第一抗體後加入biotinylated anti-rabbit 及anti-mouse 的第二抗體作用15 分鐘， 再以PBS 洗去第二抗體， 加入streptavidin peroxidase 作用15 分鐘後以amino-ethylcarbazole substrate kit （ZYMED, San Francisco, CA, USA）呈色。

二、逆轉錄酵素- 聚合酵素連鎖反應（RT-PCR）
1. 組織RNA 之抽取：
取轉殖的ML-14a細胞，以commercial kit (TRI reagent)
I. 取10 ml 的TRI reagent 加入細胞培養盤中，於室溫下靜置 5分鐘。
II. 加入 0.2 ml chloroform，與細胞混和均勻。於室溫下靜置 8分鐘。在 4℃以 12000g 離心15分鐘。
III. 將水層移至新的試管中，加入 0.5 ml isopropanol，混和均勻，於室溫下靜置 5分鐘。於室溫下以 12000g 離心15分鐘。
IV. 以 1ml 75% 的酒精清洗RNA沈澱。於室溫下以 7500g 離心15分鐘。
V. 待RNA乾燥後，將沈澱回溶於水中。
2. RT- PCR :
欲分析的RNA 先以DNase 處理過以去除HBV DNA 的干擾。First strand cDNA 的合成是以commercial kit（Gibco BRL, Bethesda,ML, USA）來完成。取3 μg RNA， 加DEPC-H2O 到11μl。加入random hexamer 1 μl， 於70℃ 作用10 分鐘後， 靜置冰上至少1 分鐘。再加入10 × PCR buffer 2 μl， 25 mM MgCl2 2 μl，10 mM dNTP mix 1 μl， 0.1 M dithiothreitol（DTT）2 μl， Rnase inhibitor（40 U/μl）0.5 μl 及reverse transcriptase（200 U）1 μl，於25℃ 作用10 分鐘後， 再置於42℃ 作用50 分鐘， 最後以70℃ 15 分鐘終止反應。所得產物可置冰上或－70℃ 儲存。
取逆轉錄所得到之cDNA 5 μl， 加入2.5 mM dNTP 2 μl，10× Taq polymerase buffer 10 μl， 合適之兩條primers（10 pmol/μl）各10 μl， Taq polymerase 1 μl 及滅菌過之二次水62 μl， 終體積為100 μl。置於聚合酵素連鎖反應器中
反應。實驗中用於偵測pre-S transcript 的primers為5'-TCCAGATTGGGACTTCAACC -3' （ nt 2973-2992 ） 與5'-GGTCCTAGGAATCCTGATGT -3'（nt 186-167）， 而偵測S transcript的primers 為5'- CCTGCTGGTGGCTCCAGT -3'（nt 56-73）與5'-CGCAGACACATCCAGCGAT -3'（nt 387-369）。