緒論
植物金屬硫蛋白
重金屬污染是近年來在開發中或者是已開發國家常發生的嚴重問題。而台灣這個寶島也無法倖免於難，近年來常有農地受重金屬污染的報導，但這都只是重金屬污染危害的冰山一角。被重金屬污染的土壤，經由生物鏈的濃縮效應，其對整個生態的毒害作用更是無法估計。根本解決重金屬污染的發生，除了杜絕重金屬污染物的排放之外，回復已受重金屬污染土地，恢復其農地使用亦是環保的一項重要課題。
早期有關植物暴露在過量金屬離子所表現的金屬硫蛋白之研究，主要以phytochelatin為主。一般認為，它在植物中所扮演的角色與低分子量金屬結合性蛋白相同(第一類型和第二類型金屬硫蛋白)。以往在分離高等金屬硫蛋白phytochelatin時，所得的其他蛋白往往被認為是純化過程中的不純物。直到近年陸續有許多報告從植物中，如豌豆(Evan et al., 1988, 1990 )、小麥(Snowden et al.1993)、白苜宿(Ellison 1996)、阿拉伯芥草(Takahashi 1991; Zhou and Goldsbrough 1994, Yeh et al. 1994)、蘋果(Reid et al., 1996)、蕃茄(Whitelaw et al., 1997)篩選出一種訊息核糖核酸，藉其核酸序列的訊息，推測其轉譯產生與哺乳動物金屬硫蛋白初級結構相似的蛋白質。這些蛋白不同於典型金屬硫蛋白之處是它們含有兩段較短但富含半胱胺酸功能區(但仍以金屬硫蛋白半胱胺酸特有區域的排列方式)，兩區之間含有一段胺基酸插入區域(約40個胺基酸殘基)，比典型的動物金屬硫蛋白的中間區域長很多(動物金屬硫蛋白是由兩個胺基酸殘基連接兩個富含半胱胺酸功能區)。這些在植物中發現的訊息核糖核酸，所推測的轉譯蛋白質就暫時稱為類金屬硫蛋白(metallo-thionein - like protein)。由於許多不同植物已經發現含有類金屬硫蛋白基因，因此此種蛋白可能便存於所有植物。
不同類型的動物金屬硫蛋白在不同組織中表現不同，如MT I和MT II主要是在肝臟、腎臟，MT III在腦部(Palmiter et al., 1992)，MT IV在舌頭(Qualife et al., 1994)。在植物的類金屬硫蛋白，以我們實驗室所研究的水稻為例，第一型的類金屬在根部表現較多，而第二型則在葉部表現較多；此外第一型受熱休克、銅離子、缺糖、老化誘發，但受生長激素ABA(abscisic acid)抑制；然而第二型受熱休克缺糖誘發但是對銅離子反而稍微抑制(Hsieh et al., 1996)
動物體中各種微量金屬各有其不同結構之蛋白與之結合，例如銅由血漿銅藍蛋白(ceruloplasmin)結合，鐵由鐵蛋白(ferritin)結合。動物的金屬硫蛋白除了結合一般微量必需的金屬離子如銅、鋅等。對於有毒害的重金屬，如鎘、鉛、汞等，也具有很高的親和性。然而在植物體中金屬離子的恆定與解毒的機制又是如何進行，尚未清楚，只知道植物的類金屬硫蛋白在酵母菌(AB-DE1)中表現，能夠回復酵母菌的抗毒性(Zhou and Goldsbrough, 1994)。
目前已被表現的金屬硫蛋白之中，大部分是是用大腸桿菌來做表現，但是所得的產量都不高，如rainbow trout MT只有1.88mg/liter culture(Kille et al. 1990)，而monkey MT也只有0.3mg/g total protein(Murooka and Nagaoka, 1987)。且在大腸桿菌表現金屬硫蛋白，因其富含半胱胺酸，表現出來之後對菌體本身會產生毒性，導致產量不高，或是形成內涵體(inclusion body)，使得蛋白純化回收困難。而以前植物的類金屬硫蛋白基因在大腸桿菌中表現，則是無法得到完整的蛋白，這可能是因為表現出來的蛋白遭到蛋白酵素的分解所致(Kille et al. 1991)。
為了解決這個問題，我們利用pET32載體將稻米類金屬硫蛋白融合在thioredoxin中，來增加蛋白質在大腸桿菌中的穩定性與溶解度，使其能夠在BL21(DE3)中可以看到大量的表現，希望能大量純化得到此蛋白，做蛋白結構分析。
米酒糖化酵素
Rhizopus oryzae米酒糖化酵素[EC 3.2.1.3, ��(1,4)-glucan glucohydrolase]是一種非常重要的酵素。在發酵工業中，澱粉要經過糖化酵素的催化處理之後，才能進行發酵製酒的反應。目前台灣菸酒公賣局每年製造米酒，估計要花兩千多萬新台幣來買這個酵素，因此，利用基因工程的方法，來大量製造此種蛋白，就是製酒業者降低成本的最好經營策略之一。
目前只有日本Suntory公司的研究部門分別在用酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和嗜甲基酵母菌(Candida boidinii)表現出米酒糖化酵素(Ashikari et al, 1989；Sakai et al, 1996)，其表現量分別為300mg/L和3.4g/L，這樣的表現量已經達到商業化的標準；我們台灣目前僅有公賣局酒類試驗所，徐祖炘研究員用pMS12載體在酵母菌中表現此酵素，其產量與日本所發表的量一樣，但是因表現載體在宿主中的穩定性不夠，所以載體在酵母菌分裂幾代之後就無法繼續表現米酒糖化酵素。所以能夠大量且穩定的表現米酒糖化酵素就成了一個極待解決的問題。
為了解決這樣的問題，Pichia表現系統可以說是一個很理想的選擇。此系統用homologous recombination的方法來轉殖Pichia pastoris，使我們要表現的基因嵌入酵母菌的染色體中，所以它可以穩定的表現外來的蛋白質，若標的基因和訊號生泰鏈做融合蛋白則可以簡化純化蛋白的程序。而且Paifer曾利用此系統表現過耐熱細菌的��-amylase，產量高達2.5g/L(Paifer, et al, 1994)。因此用本系統來表現米酒糖化酵素成功的機率是非常高的。
Pichia pastoris是一種嗜甲基酵母菌(Methylotrophic Yeast)，它可以在缺乏抑制性碳源(repressing carbon source)如葡萄糖的情況下 利用甲醇來當碳源，維持其細胞內的正常生理機能。酒精氧化酵素的作用是催化甲醇代謝的第一步驟－將甲醇氧化成甲醛(fomaldehyde)和過氧化氫(hydrogen peroxide)，其啟動子是控制酵素的表現的總樞紐(Ledeboer er al,1985)。為了要得到低特別活性(low specific activity)的酵素，Pichia在細胞內製造了大量的酒精氧化酵素，約占細胞內水溶蛋白的30%以上(Cregg et al, 1993)。Pichia表現系統即是利用強有力的AOX1啟動子，來使Pichia大量製造重組蛋白。在製造重組蛋白上，本系統有以下三點優點，詳述於下：
能夠大量的表現蛋白(High Expression Levels)：在文獻上，利用本系統表現重組蛋白的表現量最高可達12g/l(Clare, et al, 1991)。雖然表現蛋白的量因各種蛋白的性質而異，但是大部分的蛋白在Pichia系統中表現，都能比在其他系統(如細菌、昆蟲、或動物細胞表現系統)還高。
容易擴大培養(Easy Scale-up)：Pichia pastoris很容易適應大規模的發酵培養，去製造重組蛋白。目前為止，小至一公升，大至十噸的發酵槽，都有人用來培養Pichia pastoris，生產重組蛋白。
節省經費(Cost Saving)：在Pichia系統表現重組蛋白的花費要比在昆蟲細胞或動物細胞系統來的便宜，因為在生長及表現的培養基中，不需要昂貴的添加物，如胎牛血清(fetal bovine serum)。此外，也不需要有二氧化碳培養箱和細胞培養室(tissue culture room)。
目前已經有許多蛋白如酵素、蛋白脢(protease)、受體(recepter)、單鏈的抗體(single chain antibody)、蛋白脢抑制子(protease inhibitor)、調控蛋白(regulatory protein)等在本系統表現（表一）。
米酒糖化酵素由是由六百零四個胺基酸所組成(如圖一所示)，前面廿三個胺基酸是糖化酵素本身的訊號序列，是讓這個蛋白轉譯之後，送出細胞外。從267-285是活性中心，圖中用黑體字表示的胺基酸在功能上佔有很重要的地位。若這些位置發生突變，會影響糖化酵素的活性，如做D271→E、W279→F、R281→Y、Q283→H等突變會使活性降低2－10倍(Natarajan and Sierks, 1996；Frandsen et al., 1995)。由12%SDS-PAGEx9來看它的分子量約為67KD(Yu and Hang, 1991)；它可將澱粉中的非還原端(non-reducing end)之��(1,4)和��(1,6)糖鍵結(glucan link)水解而產生葡萄糖，但是他對��(1,4) 糖鍵結[Hiromi, el at, 1983; Manjunath, et al, 1983]。但就像a-amylase，它對於長鏈的澱粉會比短鏈的澱粉更具有活性，且對glycon和aglycon具有更高的特異性(specificity) [Beynum et al,1985]。所以在製酒的過程中，它可以用來分解澱粉，變成葡萄糖，因此它在發酵工業上是十分重要的酵素。
本實驗的目的是希望米酒糖化酵素基因在 P. pastoris表現，能改善在Saccharomyces cerevisiae表現的產率，甚至能夠超越Sakai所做的產量。如果有大量的蛋白表現，可以應用在米酒的製造，降低米酒的發酵成本。