LS1802基礎生命科學實驗 講義2-1
實驗二：顯微技術與生態學
--以耳石顯微分析技術探討洄游性蝦虎的生活史
實驗目的：
（一）訓練同學熟悉各式光學顯微鏡、解剖顯微鏡的使用方法和操作
技術；
（二）動物解剖學練習與生態學知識之吸收；
（三）電子顯微鏡與電子微探儀技術之基本概念；
（四）動物生理學概念。
概說
一、洄游性蝦虎生活史
以往為大家最熟知的洄游性魚類便是屬溫帶地區的鮭魚(Salmon)，
不但其經濟價值高，更因其洄游過程歷經各種艱辛與困難而廣為世人所
熟知。但在屬於亞熱帶氣候的台灣卻有著與溫帶地區洄游性鮭魚同樣洄
游模式的洄游性生物－—蝦虎科(Gobiidae)魚類。蝦虎因其經濟價值低
而體型又小，因此常被忽略，但此科魚類卻是亞熱帶地區的代表性河海
兩側洄游性魚類。它的集體洄游行為所形成的生物奇觀和生物學上所具
的意義卻絕不亞於屬於溫帶地區的鮭科魚類。
蝦虎科魚類依生活史的型態可分為兩種：陸封型（Land-locked
form）與河海兩側洄游型（diadromous form）。陸封型的蝦虎終其一生
皆生長在淡水河川或湖泊中，如廣泛分佈於全省的極樂吻蝦虎
（Rhinogobius giurinus）便是最典型也是最常見的種類，在湖泊中常
是底棲性魚類的優勢種（dominant species），在清華大學校內的相思
湖中便是一個典型的例子。
河海兩側洄游型（diadromous）的蝦虎於淡水河川中的石頭底部產卵，
親魚會選擇適當的石頭為產卵場並將石頭底部的底沙清除，用嘴巴挖出
一個小洞穴，再將卵塊黏附在石頭底部，卵的體型較陸封型蝦虎所產者
為小，屬小卵型，大小約數毫米，每次可產十萬個以上的卵（日本禿頭
鯊Sicyopterus japonicus）。母魚產完卵後會被驅離開巢穴，雄魚負責
護卵，幼魚（larvae）在數天之後孵化，並在一天之內便隨河水流入海
中，先經過數天的卵黃囊期（yolk-sac period），之後才開始進食，
並在海洋中度過一段浮游時期（planktonic period），這段時期的時間
因魚種的不同而異，如日本禿頭鯊在海洋中約度過六個月，而大吻蝦虎
（Rhinogobius gigas）則只在海洋中生活一個月。經過一段海洋的浮游
時期之後，這些幼魚便集體從海洋上溯到淡水河川內，通常這些在海中
浮游的蝦虎並不會離開河口區域太遠，並且應該是感受到海中鹽度的變
化而找尋到河口，然而目前對這段期間的蝦虎生活史瞭解的並不多。到
達河口之後的蝦虎便進入了一個截然不同的環境中，大部分的種類會在
河口停留一段時間，這些魚苗通常是成群活動，因為物種間的生存競爭
和外在環境的壓力，使得大部份的魚苗繼續地往上游河段遷徙，這和鮭
魚為了產卵而上溯的目的是不同的，但卻同樣造成了洄游的生物奇觀。
這些洄游性蝦虎將視其生存壓力和溯河游泳能力決定其上溯程度，根據
在台灣東部秀姑巒溪的調查發現，大吻蝦虎可分布至距離河口約七十公
里之遠屬玉山國家公園東部園區的拉庫拉庫溪主流，，而日本禿頭鯊則
更可以深入上游的黃麻溪和塔洛木溪等支流，並可攀爬過十幾公尺高的
瀑布，其生存河段長達八十幾公里。
本實驗選擇以大吻蝦虎為材料，讓同學們熟悉生物的各部身體形質
測量、解剖、包埋、研磨等生物實驗的必備技術和方法，同時熟悉解剖
與光學顯微鏡的使用與操作，進而從魚類耳石中來探討洄游性魚類的生
活史。
二、耳石簡介：
魚類並無外耳構造，但具有複雜的內耳構造，稱為膜迷路
（labyrinthus membranaceus），也就是三半規管。膜迷路內充滿內淋
巴液（endolympha），含有固體的耳石（otolith）。各種魚類耳石的大
小形狀各異，但同一種魚類的耳石在構造上是一致的，因此常被古生物
學家在研究化石魚類中藉以鑑定種類。板鰓魚類（鯊魚等軟骨魚類）的
耳石是石灰質的小顆粒，由粘液粘成塊狀。真骨魚類的耳石則是堅固的
凝結物，由碳酸鈣沈積而成。這些耳石和聽覺神經相連，當身體改變位
置時，耳石對感覺器官的壓力起變化，同時內淋巴壓力也發生改變，於
是感覺的訊號通過聽覺神經傳到中樞神經系統，引起肌肉反射性運動。
耳石除了在生理上負責魚體的平衡感覺以外，Pannella在1971年發
現耳石中具有規律的日週期沈積的顯微結構之後，耳石的技術已廣泛地
運用在魚類的生活史、成長速率等的研究中。我們可將魚飼養在含tetra-
cycline的水中數個小時至一天，tetracycline會與魚體內血液中鈣離子
結合，而一起沈積在耳石中，再藉由UV光的激發便可在螢光顯微鏡中觀
察到黃綠色螢光反應的一圈，以此方法我們便可在耳石做上標識，觀察
其沈積數率，大吻蝦虎的耳石便是經此方法證明為一天沈積一輪。另外
經由分析耳石中的成分我們可以回推此魚過去的某些生活環境，例如在
海洋生長的魚類其耳石中的鈣元素會被海水中微量的同族元素鍶所取代
而一起沈積到耳石中，因為鍶的原子半徑與電子雲分佈與鈣原子最為接
近。然而因為淡水中沒有鍶，因此我們若分析大吻蝦虎耳石中的鍶鈣比
的變化，便可知道此魚在海洋與淡水河川中各自生長的時間有多久。
實驗步驟：
每組有五隻魚可供實驗，若不足時可再取。
(1) 形質測量
用游標尺或是顯微鏡顯微測量法量取蝦虎魚全長（從吻端到尾端）、
頭長（吻端至鰓裂末端）、背鰭和臀鰭鰭條數、眼徑。若蝦虎魚標本彎
曲，則用手將它扶直後再行測量。
(2) 解剖
在解剖顯微鏡下用鋏子固定魚體，再用剪刀距眼後約兩個眼睛大小
之處橫向剪開魚體約一半（勿將魚頭剪斷），再向前剪開一段，約到達
兩眼之間，再以鋏子將剪開處向兩邊翻開（此處即是白色的腦部，耳石
即在腦部兩旁底部）最後用解剖針將腦翻開便可看見透明似珍珠的耳石
（左右各三顆，呈橢圓型，取最大顆者即可），將之挑出放在塑膠保存
盒中，並於盒蓋標上編號（取出耳石之蝦虎魚勿丟棄，放回標本盒）。
(3) 包埋（在抽氣櫃中操作）
以 L. R. White 包埋取出之耳石，此包埋劑須置於低溫下，故使用
時置於冰盒中。先將 2ml L. R. White 以1000p之 pipetmen 取出置於
離心管中，再用20p之 pipetmen 取 20m accelater（有毒性勿接觸到皮
膚）置於同一離心管中，上蓋之後，以vortex混合均勻 約5至10sec，再
用 1000p 之 pipet 取出注於包埋板的 well 中、約 2/3 滿最好。2ml
L. R. White 約可用於十多個 well ，視耳石數再決定用多少個 well 。
L. R. White 聚合後將耳石平放在已包埋過之 well 中，再重複上述步
驟，將 well 填滿。注意：混合均勻後之 L. R. White 其聚合時間約30
~60sec。故各種器材須準備齊全且動作要迅速俐落以爭取時間，若反應時
間還是過快則將 accelater 改為15m 。一個包埋板有21個well，由兩組
共用。
(4) 研磨與拋光
將包埋成塊材之耳石用熱熔膠固定在載玻片上，距耳石較近之表面向
上。先以 600 號之砂紙將 L. R. White 磨去，之後再用 2000 號砂紙將
耳石磨去一半直到耳石的中心點出現在平面上，再以絨布加拋光液將表面
處理光滑。因耳石很小不易看見，故一邊研磨時必須以解剖顯微鏡和光學
顯微鏡輔助觀察之，以確定研磨到何處了。此步驟為整個實驗中最技術性
也最容易失敗的地方，尤其耳石很小，很容易一下子便將整顆耳石磨掉，
故必須時時以顯微鏡觀察已經磨到何處了，請各位要有耐心慢慢磨，否則
實驗就要重來一遍了，祝君好運！
(5) 腐蝕
恭喜各位！度過難關了。
將研磨及拋光後之耳石塊材多餘的部分再研磨掉以縮小體積。之後浸
泡在8% 的EDTA(pH 7~8)中約6分鐘，再用鋏子夾起保存於塑膠盒原來的位
置中。此時耳石表面很脆弱，千萬不可碰觸！以免前功盡棄。
(6) 以掃描式電子顯微鏡計數輪數
耳石樣品準備好之後，助教會將各組樣品集合在一起、鍍金等前序作
業完成後，將安排學生觀摩掃描式電子顯微鏡(SEM, Scanning Electron
Microscope)和電子微探分析儀(EPMA, Electron Probe Microanalyzer)的
操作。
實驗結果要求：
一、熟悉解剖顯微鏡和光學顯微鏡的操作技術與原理。
二、熟練顯微測量法與魚類外部形質測量與繪圖。
三、熟練包埋技術與研磨技巧。
四、分析結果之統計與討論。例如蝦虎魚的年齡，生活史與洄游過程等等問
題。
五、 進一步的實驗可以藉由養殖大吻蝦虎苗的方法，探討魚類成長與耳石的
關係，環境因子與耳石形成和沈積的關係等等（請自己發揮創造力）。
按:第五點獨立於魚類生理生態學實驗部份
參考資料：
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