UP
回計畫二

細胞生物實驗課程

 

Aseptic technique 無菌操作 清潔放置細胞的incubator Pipettes的準備與消毒 在開放式的 bench 操作細胞實驗 倒立式顯微鏡的使用法 玻璃器皿的收集與清洗/滅菌法
結晶紫染細胞 Magnetic-activated cell sorting Giemsa 染劑染細胞 生物統計分析與取樣練習 電生理實驗 認識酵素
酵素動力學 斑馬魚受精卵的發育過程 血液中血球的分離 分散式細胞培養 石蠟切片觀察 肌動蛋白觀察

Aseptic technique 無菌操作

目的 在無菌狀態下操作細胞實驗避免污染細胞
原理 在 laminarflow中運作細胞實驗,可以避免在外面空氣中的灰塵或微生物落入細胞培養液中阻礙細胞的正常生長
材料 Culture cells、petri dishes
設備 laminar flow hood、無菌的pipette、pipette aid、酒精燈
藥品 70%酒精、medium
步驟 1. 以沾70%酒精擦拭無菌操作台表面,包括laminar flow hood 前面屏幕的內部;將要用到的medium或其他藥品自冰箱中取出,瓶身皆先以酒精擦拭過後,先置入操作台上
2.將滅菌過的pipette放在操作台側邊於操作者可便於取得的位置
(a) 若使用的是玻璃的pipette,將裝pipette桶的蓋子打開後,蓋子開口向下置於操作台側邊
(b)若使用的是塑膠 pipette,除去外層包裝後依照大小分類,置於架子上或裝在桶中
3. 要自瓶中以pipette吸取溶液時,將瓶子的蓋子打開,開口向上並放在工作台中最高位置,避免在操作時操作者的手晃過蓋口上方。
4. 把pipette頂端插入一吸球或pipette aid中,pipette不要指向自己,手也不要碰到pipette的刻度以下的部分,避免pipette要插入瓶中的部分受到污染
5.此時pipette應握在操作者的右手中。注意pipette前端不要碰到其他瓶身以及laminar flow裡面的任何表面。永遠注意著pipette所在的位置。此步驟在無菌操作技術中是很重要的,並且也是不容易的
6.以pipette吸取瓶中溶液時要將瓶子向著pipette的方向略呈傾斜,可以避免手接觸瓶口造成污染。吸出溶液到另一容器時,此容器也是一樣要略呈傾斜。如果是要將溶液注入多個瓶子時,可以將它們傾斜靠放在適當的容器架上。如果沒有適當容器架或空間可以如此傾斜放置的話,要確定將各瓶子放在操作台後方,以免在操作過程中手在瓶口晃過
7. 使用過的pipette丟入含有清潔劑的圓柱狀收集桶中,塑膠pipette則丟入有雙層厚度並且可滅菌的袋中9.全部的操作完成後,將所有容器的蓋子拴緊,移除操作台上所有實驗時移入的物品,將操作台表面以70%酒精擦拭過
時間 約半小時
備註 操作時間是依照不同細胞以及細胞多寡而定

清潔 incubator

目的 使細胞在清潔的環境中生長以減少污染機率
原理 將culture的細胞移至另外一個incubator,再將要清洗的incubator關掉,用detergent和酒精清洗之。之後把熱開關打開,烘乾incubator,最後將水重新補充回盤子內和恢復CO2的供給。
材料 fungal inhibitor和水1:1混合的溶液
設備 替代的incubator或塑膠盤、膠帶(sealing tape)
藥品 Detergent: 10% Roccall或其他 fungicidal detergent、70%的酒精
步驟 1.把所有culture移到另外一個incubator內,或是將culture放在一個盒子內,供給CO2,在將它放在incubator或hot room中。
2.將incubator的電源關掉準備清洗。
3.將incubator中所以可以拆卸的板子,水盤和隔板全部拿出來。
4.用detergent清洗incubator內部,儘量將角落和細縫清洗乾淨。
5.用清水清洗乾淨。
6.用 70% ethanol擦拭incubator內部。
7.將incubator的門打開和restore heat(不是CO2)。
8.利用detergent清洗拆卸下來的板子和隔板,再用清水清洗乾淨之後用 70% ethanol擦拭。
9.將板子和隔板裝回incubator內。
10.將水盤裝滿含有 2% Reccall的水再裝回incubator內。
11.將incubator的門關上並且恢復CO2的供給。
12.當incubator內的溫度和CO2穩定後再把culture的細胞放回incubator內。
時間 約半天
備註  

Pipettes 的準備與消毒

目的 把操作細胞實驗的pipette滅菌消毒使之無菌
原理 先利用自動清洗器以清水借虹吸效應清洗pipette後,再將之滅菌烘乾以達到無菌狀態
材料 滅菌帶、棉花
設備 Pipette cylinders、鋼製pipette收集籃、鋼製pipette桶、滅菌釜、烘箱
藥品 清潔劑和消毒劑
步驟

Ι. Collection and Washing

1. 將清潔劑和消毒劑到入放置移液管的容器內。
2.把用完移液管放入上述的容器內。
a. 通風櫥內勿堆放移液管。
b. 將接觸過agar或silicones的移液管以另外的容器存放。
3. 將移液管浸泡隔夜至少 2hr。
4. 在浸泡之後,以壓縮空氣將堵塞物移除。
5. 將移液管放入清洗機器內,尖端朝上。
6. 利用自動清洗器以清水借虹吸效應清洗至少 4hr。
7.以去離子水通入自動清洗器循環清洗。
8.將移液管放置烘箱。
9.塞入棉花。
10.依移液管的大小妥善保存之。

Π. Sterilization

1. 將移液管放入移液罐內。
2. 每罐的移液管大小相同。
3. 在一些罐子中放入不同大小的移液管。
4. 在罐子標記日期及大小。
5. 以160℃滅菌 4hr,完後放入烘箱。
6. 將移液罐自烘箱移出放在培養室(通風櫥)內。

時間 約四個半小時
備註  

在開放式的 bench 操作細胞實驗

目的 在開放式空間操作細胞實驗
原理 在不需要無菌的狀態下操作細胞實驗,但仍應盡量保持操作區域的潔淨,避免其他外界因子或化學物質污染藥品而使其變質
材料 Culture cells、petri dishes
設備 Pipette、pipette aid、酒精燈、紙巾
藥品 70%酒精、media、stock solutions
步驟 1. 以70%酒精將實驗桌面擦拭乾淨。
2. 將media等物,從冷藏或冷凍中取出回溫,以酒精擦拭瓶身,並且將你需要的放在操作區內,其餘的留在兩側。
3. 取pipette,置於操作區一測,便於拿取的位置。
(a) 如果是玻璃材質,打開pipette桶並且將桶蓋置於高處。
(b) 如果為塑膠材質,直接從包裝中取出使用,將未拆封使用的pipette整理疊於一測,或放在架上、pipette桶內。
4. 若使用的pipette為玻璃材質,從pipette桶中取出時和其他桶中pipette保持平行,儘量避免碰觸,如果碰到立刻丟棄;若為塑膠pipette,打開包裝頂端,脫去包裝,避免碰到包裝袋外側。
7. 將pipette過火,過火時須以縱向方式過火,旋轉180°使每面都能燒到,並以拖曳方式將pipette過火,而過火時間儘量在2~3秒內完成,pipette過火這個步驟是不能省略的。而過火只是單單將灰塵固定,並不能全然殺死細菌,所以當使用pipette過程中有碰到其它部位或污染,則應將pipette丟棄置換新的,不要再過火
8. 將pipette插入pipette aid時,應注意手碰觸的地方,應儘量拿pipette刻度上面位置,插入瓶子或錐形瓶中才不致污染。
9. 將pipette插入pipette aid時應以最適量的角度,須常常注意pipette位置,是否有碰到瓶口外面。
10. 當要伸入瓶子時,應以單手將瓶口打開(儘量以手指頭拿住蓋子)並以手跟靠住瓶身,傾斜適當角度後,再以另一手將pipette伸入,但注意你的手不能碰到瓶頸。將必要的液體取出後,將瓶口過火及蓋回蓋子,轉緊瓶蓋。完成操作過程後,將stock solutions移開你的工作台面,只留下所需的瓶子
時間 約半小時
備註 將pipette插入pipette aid時不應太用力以免使玻璃pipette破裂

倒立式顯微鏡的使用法

目的 了解倒立式顯微鏡的正確使用方法
原理 將培養的細胞置於顯微鏡視野下,選擇適當物鏡並運用調整顯微鏡的各種不同性質觀察細胞
材料 Slide、flask、dish
設備 倒立式顯微鏡
藥品 70%的酒精
步驟 1. 確定顯微鏡是乾淨(可以用70%的酒精擦拭)
2. 打開電源,將燈的強度由最弱調到最適合的強度,不要在強度最大的時候關掉.
3. 檢察condenser 和光源的連繫
(a) 放stained slide,flask,dish在鏡台上
(b) 關起field aperture
(c) 聚焦在iris aperture
(d) 將成像調在視野中央
4. 將phase ring 置於中央
(a) 假如顯微鏡配有phase telescope,將之插入standard eyepiece.然後聚焦在phase ring,檢查是否和condenser ring在同心圓上.
(b) 假如顯微鏡無配有phase telescope,可將stained specimens取代unstained culture,重新聚焦,調整phase ring直到optimum contrast 形成.
5. 檢查細胞,一個10倍的像位差物鏡可以用做一般詳盡的觀察,越高倍的物鏡所看到的視野則越小.
(a) 記錄生長的情形(如全滿,半滿和細胞聚集的情況)
(b) 記錄細胞的形態(如是否呈顆粒狀)
6. 檢查medium是否乾淨,以及是否被汙染,並且將汙染的情況記錄
7. 記錄你的觀察8. 觀察結束後將電阻器及開關關起
9. 將你的細胞重新放回培養器.
時間  
備註  

玻璃器皿的收集與清洗/滅菌法

目的 將使用過的玻璃器皿清潔與滅菌
原理 利用清潔劑與消毒劑先將玻璃器皿初步清洗後,再放入滅菌釜中滅菌使達到無菌狀態
材料 玻璃器皿
設備 刷子、不袗籃子、鋁箔紙、滅菌釜、滅菌指示帶
藥品 消毒劑與清潔劑
步驟

玻璃器皿的收集與清洗

1. 使用後立即將玻璃器皿放入具有消毒劑之容器中。(不要使玻璃乾掉否則更難清洗)
2. 在清潔劑中浸泡整晚。
3. 用刷子刷過器皿內部,並使用水龍頭的水沖洗四次,繼而用二次水沖洗三次。
4. 潤洗過後,將器皿倒立放置於不袗籃子內並烘乾。
5. 瓶蓋使用鋁箔紙封住並保存。

滅菌法

1. 貼上滅菌指示帶於器皿上並標示日期。
2. 將玻璃容器放入滅菌釜之中並設定160℃。
3. 確定其中心位置是否達160℃。
a. 放滅菌指示物在一個容器之中,並將其放置在滅菌釜中心。
b. 如果使用記錄溫度計將其放在一個容器之中,並將其放置在滅菌釜中心。
c. 不要將瓶子鎖太緊使熱氣無法進入。
4. 開啟滅菌釜加熱待溫度到達160℃時,封住滅菌釜。
5. 一小時候關掉滅菌釜,並使其自動回復到室溫。
6. 取出後在24-48小時內使用。

時間  
備註  

結晶紫(crystal violet)染細胞

目的 利用結晶紫染細胞後以顯微鏡觀察
原理 將培養細胞以methanol固定,以結晶紫染劑染細胞後,以去離子水洗過,待乾燥後才觀察。結晶紫使細胞核呈深藍色,細胞質呈淺藍色
材料 Culture cells
設備 Pipettes 、去離子水
藥品 PBS、PBSA/MeOH:1:1 PBSA:methanol、methanol、結晶紫
步驟 1. 移去medium
2. 用PBS rinse,並將之移除
3. 在每25cm2中加入5ml的PBSA/MeOH,等待二分鐘並將之移除
4. 加入5ml 新鮮 methanol,等待10分鐘
5. 移去methanol,並乾燥
6. 在每25cm2中加入 5ml 的結晶紫,等待10分鐘
7. 在瓶中放入filter funnel
8. 將染劑倒入filer funnel
9. Rinse 盤子用tap water,再用去離子水,乾燥
時間 約半小時
備註  

Magnetic-activated cell sorting (MACS)

目的 分離細胞
原理 Buffy coat 或其他混合的細胞懸浮液(已經和conjugated- antibody microbeads混合),稀釋後至入磁分離的管柱,細胞和microbeads結合的會留在管柱中,其餘未結合者的流出管柱,留在管住中的細胞藉著磁石及活塞由管住中分離出來.
材料 磁化的microbeads 和抗體接合,這種抗體會認識細胞表面的抗原收集管(適當的體積會被收集): MS+/RS+ 1ml ; LS+/VS+ 5ml
設備 磁化細胞分離器: MiniMACS, MidiMACS, VadioMACS, SuperMACSRS+ 或 VS+ 管柱接合器、Positive selection 管柱: MS+/RS+ 細胞到 達1 X 107 ; LS+/VS+細胞數到達1 X 108
藥品 Buffer: PBSA, PH 7.2, 0.5% BSA及 2mM EDTA
步驟 1. 藉由標準步驟或製備細胞懸浮液(藉由胰蛋白脢的酵素作用或其他的步驟; protocol 12.2,11.5,11.8,分離出週邊血液單核球)
2. 利用Ficoll-paque移去死亡的細胞
3. 藉由細胞通過30微米的尼龍網孔或膜移去細胞團(在使用前需用buffer將膜弄濕)
4. 藉離心沖洗在buffer中的細胞,
5. 每1 X 107的細胞用80微升的buffer 將離心好的細胞打散
6. 每1 X 107 的細胞加入20微升的MACS microbeads
7. 混合並培養懸浮液6-12 ℃,15分鐘
8. 藉加入10-20倍已知體積的buffer去稀釋懸浮液
9. 離心300g,10分鐘
10. 移去上清液,並用每1 X 108 的細胞加入500微升的buffer, 使細胞 連結著miceobeads的復合體resuspendPositive magnetic separation:
11. 將管柱放到MACS分離器的磁場中
12. 沖洗管柱: MS+/RS+ 500μl ; LS+/VS+ 3ml
13. 細胞懸浮液加入管柱中: MS+/RS+ 500-1000μl ; LS+/VS+ 1-10ml
14. 帶負電的細胞會通過管柱
15. 用buffer清洗管柱: MS+/RS+ 3 X 500μl ; LS+/VS+ 3 X 3 ml
16. 從分離器中移除管柱並將管柱置於收集管上
17. 吸取buffer到管柱中: MS+/RS+ 1ml ; LS+/VS+ 5 ml, 用管柱的 plunger沖出帶正電的細胞 計數細胞,調整培養機的濃度至1 X 105_1 X 106細胞 / ml, 將細胞 種到flask上(for primary culture); 將10-1000細胞 / ml 種到Petri dishes (for cloning)
時間  
備註  

Giemsa 染劑染細胞

目的 利用Giemsa染細胞後以顯微鏡觀察
原理 將培養細胞以methanol固定,直接以Giemsa染細胞後,再以水洗過,並在細胞還是濕潤的狀態下以顯微鏡觀察之。Giemsa使細胞核核任呈深藍色,而細胞質呈灰藍色
材料 Culture cells
設備 Pipettes、去離子水
藥品 PBS、methanol、anhydrous methanol、Giemsa染劑
步驟 1. 移去medium
2. 用PBS洗去medium,並將PBS移去
3. 加入5ml PBS/methanol 在每25cm2,等待二分鐘之後,將之移除
4. 加入5ml 新鮮methanol,等待十分鐘
5. 移去methanol,用新鮮anhydrous methanol代替.Rinse後,移去methanol
6. 盤子要保持乾燥,以及加入新鮮的anhydrous methanol才可以染色,如果放置過久則會吸收空氣中的水份,會影響染色.
7. 加入 Giemsa染劑, 每25cm2加入2ml ,確定染劑會將細胞淹過
8. 二分鐘之後,用8ml 水脫染,之後輕輕搖晃二分鐘.
9. 用水去洗,將浮在上面的浮渣去除,再用running tap water將背景的紅色洗去.
10. 倒去水,用去離子水rinse 細胞,在溼潤的環境下觀察細胞.
時間 約半小時
備註 觀察過程中若細胞乾掉,就要再一次以水濕潤細胞以便觀察

基本生物統計學分析與樣本取樣練習

目的 許多生態學的研究需要取得大量的數據加以分析,但是在本質上,不論是關於環境因子,個體,族群,群落或整個生態系的資料比起許多研究領域的資料而言,常常會有較高的變異性.因此不論是實驗設計,樣本取樣,或統計分析對於一個生態學家要得到客觀有效的實驗結論都有舉足輕重的影響.這個實驗室希望讓學生透過一些簡易有趣的測量,觀察,操作及討論,實際體會幾項基本的生物統計學觀念及技巧.
原理

Part1

當我們希望量化描述一個群體的特性,我們常常會用平均值(mean),及標準差(standard deviation)來概廓說明結果,或者是依照其分布(distribution)情形來討論全體的狀況,此時直方圖示常用的表示方法.許多自然界的測量值都是常態分布,這一部份的實驗讓學生測量青江白菜胚根的長度,計算其平均值,標準差,並分兩大群以直方圖統計,比較分布曲線是否接近常態分布.最後,以司徒頓分配(t-test)來比較兩群樣本的平均值,檢試虛無假設(null hypothesis)看看這兩群樣本是否來自同一個母體

Part2

一般而言生態學研究會針"樣本"作分析.樣本即是一個母體(具有一些我們感興趣的屬性,如數量,大小)的一小部份.要取樣的原因是因為要捕捉,測量所有的個體是非常耗時或/且昂貴的,其實我們只要隨機取出一部份樣本便可以得到與做完全體測量的結果相近的結論.然而,如何取出足以代表母體的樣本是實驗設計上的重要考量.這一部份的實驗就是要讓大家動動腦來想想取樣時可能產生的誤差,了解會影響捉放法準確性的因子.捉放法最早由丹麥的漁業學家.G.J. Petersen在1890年代發展,在1930年代後開始使用在其他生態學的研究.主要的做法是將群體中的一部份成員作上標記,再放回群體中,之後重新取樣,計算有標記者的比例,進而依據下列的公式估計這個群體的總數量.作上標記的總數(M)/群體大小(N) = 取樣中有標記的數目(r)/取樣的總數(n)

材料

Part1

青江白菜在室溫下培養兩天之幼苗 200顆直尺Microsoft Excel

Part2

以一比例混合的紅豆及綠豆共500顆以一比例作標記的蠶豆共200顆各種種子各種容器

設備 電腦
藥品
步驟

Part1

1. 全班分成10組,每組取20顆白菜芽測量胚根長度,計算出平均值及標準差
2. 將長度分布紀錄於電腦上;1-5組結果匯成一群(A),6-10組為另一群(B)
3. 找代表計算A.B群及全部200顆種子的平均值及標準差,比較20顆,100顆及200顆的平均值及標準差有何差別?討論取樣數量對於統計結果的影響.
4. 找代表作出A.B群的直方圖,看看像不像常態分布曲線?
5. 設立虛無假設,計算出t-test的t值,查表(注意自由度)決定是否接受假設.

Part2

1.全體分成10組,各組輪流,每人閉眼從桶中抓出一把豆子,取10,50,或100顆種子,紀錄綠豆與總數的比例(r/n),寫在白板上,檢視取樣數目與求得的比例有無相關.
2. 每組輪流每人從桶子中取出50顆蠶豆紀錄作上標記的與取樣數量的比例(r/n). 在排隊等待的同時,各組討論利用實驗室現有的器材及所提供的種子設計一個方式作捉放法的實驗,與蠶豆實驗的結果比較並討論變因.提示-顏色,大小,取法,標記數量…..

時間 約3小時
備註 第二部分著重'實驗變因的控制對於實驗結果的影響'的觀念建立

電生理實驗 -- 鰲蝦逃跑神經迴路之解剖練習與插電極

目的 在電生理實驗的部份,我們要紀錄螯蝦(crayfish)逃跑神經(Lateral Giant(LG)) 的靜止電位及興奮性突觸後極化電位(excitatory postsynaptic potentiation (EPSP). 為了要有狀況良好的神經及完整的LG迴路,我們先練習如何避免在解剖的過程中傷害到突觸間的連結.熟練後儘量縮短解剖的時間,避免燈光的照射產熱使神經的活性降低及膜的表面發生變化,不利玻璃電極的穿刺.
原理 細胞會因為內外離子濃度不等加上各種離子通道的作用,造成細胞膜內外有微量的電位差,可以想像有一層正電離子或負電離子的薄膜分布在細胞的內外表面。在無刺激的情形下,神經元細胞的靜止電位(resting potential)約為-70mV。一但受到夠強烈的刺激,神經細胞可以藉由動作電位(action potential)的產生長途傳遞膜電位的變化。當兩個神經元藉由突觸(synapse)相接,訊息便可以由前一個神經元傳給下一個神經元。在解剖得到的螯蝦逃跑神經迴路中我們可以清楚的看到primary afferent及LG。若將內含3MKCl電阻值為0-15MΩ的玻璃電極插入LG軸突的起始體節內,將成對的銀線電極置於N234(primary afferent nerves)處,施加適當強度的電刺激,就可以記錄到EPSPs﹔由於刺激傳遞所經的途徑不同造成反應產生的時間差,我們可以觀察到α和β兩種EPSPs。若將刺激電極置於第五及第四神經節之間給予適度的刺激,可紀錄到LG與MG的主動電位(action potential)。
材料 美國螯蝦
設備 解剖剪刀 / 鑷子 / 解剖盤 / 固定針 / Head Stage / 電極(Electrode) / 放大器(Amplifier/Filter)) / 訊號產生器(Stimulator) / 類比/數位轉換器(Analog/digital Converter) / 示波器(Oscilloscope) / 電腦(Computer) / 解剖顯微鏡 / 三向微細操作儀
藥品 Crayfish buffer
步驟 1.將螯蝦置於冰上麻醉
2.剪去頭胸部,再沿U字型剪去背殼 *Note:沿著殼與肌肉中間的空隙剪去附著於殼上的肌肉
3.將蝦尾用固定針固定於解剖盤上,倒入螯蝦生理緩衝液,鑷起大團肌肉,找到附於腹部底部中央的神經之後,小心沿著神經剪斷與肌肉中間的連結處,使神經裸露
4. 格外小心處理接近第六個神經節(G6)的部份,在剪去神經上方的肌肉時儘量不要拉扯或剪到N2,N3,及N4,只要使其裸露一小截將來可以用電刺激即可
5. 將解剖得到的螯蝦神經(蛙卵)置於顯微鏡下。
6. 裝置好玻璃電極,於視野下找到電極針頭,浸入液面後將電位顯示調整歸零。
7. 於視野下將刺激銀線微靠於afferent上方。
8. 調整針頭位置,轉動manipulator的細調節輪使針頭接近細胞膜表面。
9. 用瞬間刺激(buzz in)或輕敲電極上方使電極進入神經元細胞。
10. 直接讀取或開啟電腦程式紀錄靜止電位。
11. 調整適當之刺激伏特數刺激並記錄EPSP或action potential。
時間 約需3小時
備註 此實驗需要多幾次課程時間的練習才能較熟練技巧

認識酵素 -- 葡萄糖澱粉酵素

目的 了解酵素的特性及影響其作用的因素之一-溫度並練習實驗設計的觀念
原理 澱粉酵素有許多種,它們"切"澱粉的方式卻有些不同﹔葡糖澱粉酵素是一種可以將澱粉水解還原成葡萄糖單元分子的一種酵素,平時存在於一些真菌體內較多。當澱粉被葡糖澱粉酵素水解成葡萄糖單元後,便不能使碘溶液呈藍紫色,而澱粉的數量(濃度)會影響溶液顏色的深淺,一定量的澱粉溶液隨著水解過程的進行,可與碘分子形成藍紫色複合物的澱粉分子的數量會下降,因此,與酵素作用越完全的澱粉溶液來做碘測試的藍紫顏色會越淺,甚至呈現碘液的淡紅棕色。今天我們就用簡單的比色法來作反應進行程度的測定﹔一開始配好10管不同濃度的澱粉溶液,加入定量的碘溶液,作為比色標準,接下來反應的測試皆與之比較。溫度對於化學反應的進行有顯著的影響,通常酵素有最適宜的反應溫度,溫度過低反應減慢,溫度過高則會破壞酵素使其失去活性.
材料 10X 葡糖澱粉酵素(GA) (50μg/ml)
設備 水浴槽: 設定為25℃,37℃,65℃
微量吸量管 1000μl,200μl
試管
試管架
藥品 0.7% 澱粉溶液 / 稀碘溶液
步驟 1. 取11根乾淨的試管依照下表(單位: μl)配製不同濃度的澱粉溶液,混合均勻後,在各管中各加入200μl的碘溶液,搖勻後依序排列於試管架上
編號
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0.7%澱粉溶液
0
100
200
300
400
500
600
700
800
ddH2O
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
2. 熟悉比色法
3. 各組自行討論實驗方法畫出在指定溫度下的反應物濃度對時間的關係圖提示:碘溶液會終止葡糖澱粉酵素的催化反應
4. 比較各組的結果,檢討實驗方法的設計並討論溫度對於反應速率的影響
時間 約三小時
備註  

酵素動力學簡介

目的 學習酵素動力學的觀念及其應用
原理 酵素動力學是以動力學來說明酵素對基質分子的催化行為。酵素動力學形成的基礎觀念是"過度狀態濃度衡定"的觀念。早在1913年,Michaelis及Menten發現有關酵素與基質反應的一些行為模式,他們提出:
1. Steady State理論:酵素催化時,基質先與酵素結合形成過渡狀態,再轉變成產物,且酵素與基質的結合是可逆的。當反應達穩定狀態(Steady State)時,其中的[ES]濃度不變(即ES的生成量等於消失量)。
2. 酵素行為的數學描述:反應速率(v)與酵素或基質的關係,可以用數學式來表示﹔在固定的酵素量下,反應速率和基質濃度([S])成雙曲線關係(但只有雙曲線一股),可以用公式表示之,即Michaelis-Menten(M-M)動力學公式。v0 = Vmax [S] / (Km+[S])將M-M動力學公式變化一下作出雙倒數圖,即可清楚地由圖上看出Km和Vmax值。Km和Vmax值是每一個酵素極重要的性質指標,可以顯示其催化特性。Km是酵素與基質間親和力的指標,Km越大親和力越小﹔Vmax則是在足夠的基質濃度下,一定量酵素所能催化的最高反應速率。酵素動力學中雙倒數圖的另一項應用是研究抑制劑的作用方式(參見附圖)。
材料 10X 葡糖澱粉酵素(GA) (50μg/ml)
設備 微量吸量管 1000μl,200μl
試管
試管架
分光光度計
電腦或計算機
藥品 0.7% 澱粉溶液
稀碘溶液
步驟

1. 依下表比例配製數個不同濃度的澱粉溶液(6.7.8.9)2700μl置於不同試管中,反應前各加入300μl 的10X葡糖澱粉水解酵素混勻

編號
6
7
8
9
0.7%澱粉溶液
1800
2100
2400
2700
ddH2O
900
600
300
0


2. 在室溫下反應0,5,及10分鐘後,各加入600μl的稀碘溶液終止反應及呈色,搖勻後靜置,吸取上清液測量其在580nm的吸光值,紀錄結果並比較助教事先做好的標準曲線換算成當時的澱粉濃度
3. 利用前面算出的濃度,進一步計算出5,及10分鐘內的平均反應速率(v)。並作出兩條1)起始受質濃度([S])對反應速率(v)的曲線 2)雙倒數圖
4. 比較兩種反應時間作出的曲線,並依結果計算Km及Vmax

時間 講課約1小時,操作約一個半小時
備註  

斑馬魚受精卵的發育過程

目的 練習觀察以及紀錄的能力,並以Zebra Fish發育過程為例,入門發育學的領域。
原理 發育觀察最重要的就是觀察動物是如何從胚胎變成成體的,因此型態上面的變化是觀察的主要目標,紀錄形式則以照相或攝影為主,並且輔以各種染色、追蹤等技巧,以找出發育上的重大的型態變化和特別的規則,在分子生物學發達的今日,更重要的是找出哪些基因/蛋白質,負責這些型態的變化,以及透過那一種的訊號互相聯絡。利用照片或影片,科學家可以精確地指出變化的位置和隨著時間的演進。斑馬魚很容易飼養,當給予適當比例的公母魚群特定的光週期,加上合適的空間及水質條件,便可以人工促其交配和產卵,受精卵置於去氯的水中三天內可以發育成自由活動的魚苗。
材料 預先收集好的斑馬魚受精卵
設備 解剖顯微鏡
塑膠滴管及培養皿
藥品 保存液-多聚甲醛(paraformaldehyde)
步驟 1. 於第一天早上收集新鮮受精卵約100顆,在三天內於各特定的發育時期採樣,置入多聚甲醛中固定,存放於冰箱。
(hr)      (stages)
zygote period
0       1-cell
cleavage period
0.75      2-cell
1       4-cell
1.25      8-cell
1.5      16-cell
1.75      32-cell
2       64-cell
blastula period
2.25      128-cell
2.5      256-cell
2.75      512-cell
3       1k-cell
1.33      High
3.66      Oblong
4       Sphere
4.33      Dome4.66 30%epiboly
Gastrula period
5.25      50%epiboly
5.66      Germ-ring
6       shield
8       75%epiboly
9       90%epiboly
10       bud
segmentation period
10.33     1-somite
11.66     5-somite
16      14-somite
19      20-somite
22      26-somite
pharyngula period
24      Prim-5
30      Prim-15
36      Prim-25
42      High-pec
hatching period
48      Long-pec
60      Pec-fin
72      Protruding-mouth
2. 課堂當天利用解剖顯微鏡觀察及紀錄,討論各個時期的特徵。
3. 觀看斑馬魚發育過程的短片。
時間 孵化於卵需時一天,菜及樣本需時1-3天,視收集的時期範圍而定.觀察及紀錄約一小時,講解約一小時
備註  

血液中血球之分離

目的 「分類」為人類認識大自然生物最基本的法則,想要瞭解人體生命運作的奧秘,必須先對細胞做型態及功能上的做分類,這些看似簡單的想法,卻是往後探究生命活動的基礎。此實驗是以血液這個「混合物」為例子,利用離心的方法分離出各種成分並進一步觀察血球細胞。
原理 血液像河流一樣,主要是水分,就是血液中液體的部分,稱之為血漿(Plasma)。在這流動的液體中也有一些浮游生物,就是紅血球(Red blood Cells)、白血球 (White blood cells)、和血小板(Platelets)等,它們大小不一,形狀不同,數量也不同。體積以白血球最大、紅血球次之、血小板最小;數量以紅血球最多;白血球有核行動有自主性。由於血液細胞依不同種類都有其特定的密度,如:紅血球還有大量的血紅素,而血紅素中又含有鐵,因此在血球細胞中其密度最大,因此利用不同溶液的密度,使細胞在離心的過程中,會分佈在與其密度相同的溶液介面。粒子在離心時,其 分子量、分子密度、組成、形狀 等,均會影響其沉降速率,沉降係數即用來描述此沉降性質;其單位為 S (Svedberg unit),每一種粒子的沉降係數與其分子密度或分子量成正比。 不同沉降係數的粒子可利用離心法在密度梯度中作分離。
材料 血液(5ml):前一天預先抽出,以heparin防止凝血,為各種血球細胞的來源。
設備 懸臂式離心機 (直徑10cm)
離心管 
玻片
藥品 Ficoll-Paque溶液
食鹽水:低張,等張(約0.4%),及高張溶液
步驟 1. 10ml離心管內加入5mlFicoll-Paque溶液,再緩慢的將5ml血液加入離心管。(注意!兩者不能混合。)
2. 在18℃下,以3000rpm的離心速度,離心30分鐘。
3. 離心後,離心管內會分成不同的溶液層。記下所見到的分層
4. 將各層作成玻片標本觀察,看各種血球的型態。
5. 吸取紅血球那一層溶液,分別以低張,等張及高張溶液稀釋十倍後滴一滴在載玻片上,蓋上蓋玻片,以400X觀察紅血球的型態,討論滲透壓對於細胞的影響。
時間 約一個半小時
備註  

分散式細胞培養技術介紹與細胞存活計數

目的 介紹分散式細胞培養的基本觀念及技巧,含細胞培養室介紹,生長曲線,檢視培養液,分盤,凍細胞,及存活細胞計數。期能透過觀察狀況較差的細胞及計數受藥劑傷害的細胞存活數,讓學生了解到例行維持細胞培養的重要。
原理 所謂的細胞與組織培養,是指在活體外利用人工供給的養分來維持從活體內取出細胞的生命。在十九世紀末,即有成功組織培養的例子,不幸的是只能維持幾天,而且並不穩定,一直要到廿世紀初期,Harrison、Burrow與Carrel等人才開始穩定的、長時間的培養細胞(最長可達34年之久),暗示了可以像操作細菌或酵母菌般地進行生化或是分生實驗,此時也建立了許多未來組織培養的技術及試液,然而,儘管其潛力無窮,培養的技術仍需要非常仔細及精密的操作,使得大部分的科學家怯而不前。分散式的細胞培養(dispersed cell culture),意即利用打散的組織來培養,而不使用整個組織,如此一來簡化了組織培養的手續,增加細胞的存活率,以及方便了控制以及操作細胞的環境,但是則犧牲了生理環境的相似程度。將切下的組織打散之後,再植在培養皿上,如此養出的細胞是單層的,對於觀察、操作都方便許多,藥品可以直接作用在單層的細胞上面,要洗去藥物也相當容易。
分散式的細胞培養和細胞株成為今日主要的實驗方式。
依照其來源來分:
1.Primary cell culture:直接從生物體中取出來的細胞,在體外沒有經過任何分裂,這類型的細胞培養主要是為了取得已分化的細胞,通常沒有辦法由細胞株代替,缺點是這類型已分化的細胞大都不會再分裂,因此只能培養一段有限的時間。例子:神經細胞培養、淋巴細胞(例如:白血球)培養
2.細胞株或母細胞培養:可以進行多次細胞分裂,能夠培養一段很長的時間,對於細胞株而言,則幾乎可進行無限次的分裂,達到不死的狀態。不過這類型的細胞通常是未分化的母細胞,或是轉型過的細胞株,與體內的細胞有很大的差異。細胞培養尤重無菌操作,例行的維持也才能保持細胞狀況良好。
材料 培養於35mm dish的中國倉鼠卵巢細胞(CHO K1)
設備 無菌操作台
二氧化碳培養箱
倒立式顯微鏡
水浴槽
藥品 各類藥劑 (10%漂白水)PBS (Phosphate Buffered Saline)Trypsin/EDTAComplete medium (MEM/ F10 +10%FCS)
步驟

觀察

*不佳的細胞培養
1. 過滿且未換培養液
2. 黴菌感染(contamination)
3. 被溶解的細胞
4. 懸浮的死細胞

*比較用PBS及用complete medium培養的細胞,討論為何有這樣的差別。

*比較在37℃及在低溫下培養的細胞,討論為何有這樣的差別。

細胞存活計數
1. 取一盤前一天預先培養在培養皿的中國倉鼠卵巢細胞,選擇一個condition (control,加0.25ml10%漂白水)先用滴管吸去上方的培養液,棄置於漂白水中。
2. 加入1ml的PBS輕微搖晃後吸去,用以洗去原先殘留的培養液,避免其中的血清抑制trypsin的作用。
3. 加入1ml的trypsin/EDTA 輕微搖晃並輕敲培養皿底部,經過1-2分鐘確定細胞懸浮之後直接加入2ml含10%血清的培養液,以滴管吸放數次以均勻打散細胞。
注意: 過程中儘量避免氣泡的產生及液體濺出。
4. 用微量吸量管吸取0.5ml 的0.4%trypan blue,0.3mlPBS,及0.1ml細胞液(若細胞密度過低,可再加0.1ml),於微量離心管中均勻混合。
5. 吸出一滴混合液置於載玻片上,蓋上蓋玻片(可事先在蓋玻片上畫出欲計數的區域)於顯微鏡下觀察,分別紀錄未被染色的活細胞數及被染成藍色的死細胞數,比較各組的結果。

時間 實驗約2小時,講解約1小時
備註 視人數調整實驗的進行,若設備不夠(如無菌操作台及倒立式顯微鏡檯數有限),可考慮於一般實驗室進行計數工作,也可用光學顯微鏡辨識未被染色的活細胞及染成藍色的死細胞。

石蠟切片觀察

目的 學習組織切片觀察的技巧
原理 石蠟切片的原理是將樣本的組織灌入石蠟,使得其質地像石蠟一般(想想化石形成的原理),才能既而將其切成約10μm的薄片而不損壞樣本的構造形狀。樣本應依序經由
1)固定.
2)脫水
3)包埋.
4)切片.
5)染色及
6)封片
等步驟製作成可觀察及保存的玻片標本.
材料 美國螯蝦1公分的幼蝦(或其他沒有過硬外骨骼之小樣本皆可)
設備 rotary microtome(迴旋式切片機)
water bath(水浴槽)
hotplate(加熱板)
light microscope(光學顯微鏡)
真空抽氣機(可定溫)
石蠟填充機
數位相機
電腦及影響編輯軟體
slide, coverslip
染缸若干
玻片架若干
藥品 Mayer's glycerol albumen(蛋白膠)
Xylene(histosol)(清洗劑-脫酒精,使組織透明化)
70%,80%,95%,100% alcohol(脫水劑)
Eosin
Mayers haematoyline
synthetic mount(封片膠)
石蠟
步驟 1. 固定: 在實驗開始前1-3天將活的標本浸泡於福馬林(formalin)中固定,若樣本有外骨骼,體積又相對的較大(1cm)時可以細解剖刀片在其表面劃幾刀使福馬林較易滲入。
2. 脫水: 依序由低濃度到高濃度(最後為100%)的酒精漸進脫水
70% alcohol 1.5hr
80% alcohol 1hr
95% alcohol 1hr
95% alcohol 1hr
100% alcohol 1hr
100% alcohol 1.5hr
histosol 1.5hr for dealcoholization
histosol 1.5hr
3. 包埋: 將樣本置於樣本皿中間底部,填充石蠟(石蠟填充機要先預熱使石蠟融化),真空抽氣使石蠟滲入組織(65℃),之後由65℃真空抽氣機中取出後靜置待其自然冷卻。
wax (with vacuum) 1.5hr
再填一次wax(with vaccuum) 1.5hr
4. 切片:將樣本周圍多出的蠟塊以單面刀片修去,修成合適的梯形。將樣本卡於切片機的樣本放置處,設定好角度使梯形的上下邊與刀片平行,並使突出的面恰與刀片相接。安置好樣本後,調整切片機刀片的角度(約10度)及切片厚度(約10μm),轉動把手切片,使切片成帶狀且不捲曲(若不能則再檢查刀片,角度等因素作適度調整),用水彩筆輕挑至溫水(45℃水浴槽)中展蠟,用事先準備好之沾有蛋白膠之玻片(需確定玻片上的蛋白膠已夠乾之後樣本才不會在染色過程中脫落)撈起蠟片並烘乾(45℃加熱板)
5. 染色: 將沾有樣本的玻片排列於鐵架中,依下列順序經各染色缸中染色。注意回水及脫水的程序及染色時間,可嘗試不同的染色時間已得到最好的效果:
xylene 15min
xylene 15min
100%alcohol 6dips 以下四步為脫蠟回水步驟
95%alcohol 6dips
80%alcohol 6dips
70%alcohol 6dips
water 15min
Mayers haematoyline 約10min 以下三步為染色步驟
Water 10min
Eosin 6dips
70%alcohol 6dips
80%alcohol 6dips
95%alcohol 6dips
95%alcohol 6dips
100%alcohol 6dips
100%alcohol 6dips
xylene 10min 脫酒精
xylene 10min
6. 觀察顏色是否適當,是的話用封片膠封片,注意避免產生氣泡
7. 將欲觀察的部位在光學顯微鏡下以數位相機拍照,再用影像編輯軟體組合,紀錄。
時間 樣本準備1-3天,脫水1天,切片+染色+封片觀察約3hr
備註 通常樣本的準備(1)-(2)需要1-3天

肌動蛋白觀察 -- 鬼筆環呔(Phalloidin)染色

目的 Understand the following:
1. Roles of actin in cell structure, cytokinesis, cytoplasmic streaming, amoeboid movement and cell motility
2. Effects of phalloidin on actin polymerization and depolymerization
3. Detection of F-actin by fluorescently by viscosity
原理 Actin is a ubiquitous protein on the cytoplasm of eukaryotic cells. It is often the most common protein, comprising up to 10% of the total protein of the cell. There are at least six different actins known, four alpha-actins which are found in various muscle cells, and one beta-actin and one gamma-actin found in all cells. Actins are approximately 400amino acids long (MW 42000) and can exist in two forms, as a monomer (G actin or globular actin) and as a long helical filament (F actin or filamentous actin). Actin filaments are the microfilaments of the eukaryotic cell, which are involved in cellular structures, cytokinesis, cytoplasmic streaming, amoeboid movement, and cell motility. There are a number of actin-binding proteins in eukaryotic cells which influence microfilament structure or control actin polymerization.Phalloidin is a cyclic peptide that comes from Amanita phalloides, a highly poisonous mushroom. Phalloidin, like cytochalasin, blocks cell movements that require the turnover of microfilaments. Phalloidin binds to actin units in microfilaments and prevents their depolymerization. Thus, microfilaments are in effect locked by phalloiding
材料 Cell cultured on coverslips
設備 Fluorescent microscope
藥品 *PFA 2%in PBS, containing 5% cytoskeletal extraction buffer
*cytoskeletal extraction buf.:0.5%Triton-X, 50mM NaCl, 300mM sucrose, 3mM MgCl2, 20μgmaprotinin, 1μg/ml leueptin, 1μg/ml pepstatin, 1mMPMSF, 10mM Pipes pH8.8
*Dilution buffer:0.1% BSA, 0.05%Tween in PBS
*Blocking buffer: 10%BSA in PBS or skim milk powdered 5% in PBS
*Mounting media: antifade (Molecular Probes)
步驟

1. Fixation:
1) wash 1Xwith PBS, aspirate completely
2) Add ice cold PFA solution for 15min(can be refrigerated in PBS for several days if necessary)

2. Single Staining FITC Phalloidin(green)
1) wash 4X PBS
2) Add Triton-X 0.3% in PBS 5min
3) Rinse 2X PBS
4) Aspirate
5) Add FITC Phalloidin (indilution buf.1:40)
6) Incubate for 30 min covered and humidified (4 ℃ or R.T.)
7) Wash 4X PBS
8) If want nuclear staining, add propitium iodine (PI 1μg/ml)5min (stain red), rinse 4X PBS

3. coverslip and mount
1) Label coverslip for conditions
2) Add 3-4seperate drops of mounting media (4 μl) on rectangular coverslips
3) Place in top corners and middle of bottom
4) Extract 5.4mm dia coverslips from 96 wells with tweezers and sharp pointed spatrola
5) Touch the edge of the 5.4mm dia coverslip onto kim-wipe tissue to dry by capillary action
6) Invert 5.4dia coverslips (cell side down) onto drops
7) Let set covered over night at R.T.

4.Observation under fluroscent microscope

時間 About 1.5hrs, O/N
備註  

 

   
   
   
   
   
   
   
   

 

   
   
   
   
   
   
   
   

 

   
   
   
   
   
   
   
   

 

   
   
   
   
   
   
   
   

 

   
   
   
   
   
   
   
   

 

   
   
   
   
   
   
   
   

 

   
   
   
   
   
   
   
   

 

   
   
   
   
   
   
   
   

 

目的  
原理  
材料  
設備  
藥品  
步驟  
時間  
備註  

 

目的  
原理  
材料  
設備  
藥品  
步驟  
時間  
備註  

 

目的  
原理  
材料  
設備  
藥品  
步驟  
時間  
備註  

 

目的  
原理  
材料  
設備  
藥品  
步驟  
時間  
備註