一.1 摘要

   MMP跟腫瘤發生有極大的關係，腫瘤轉移須降解細胞外基質，而MMP是可降解細胞外基質的水解酶之一，它與原位的增殖性腫瘤到侵襲轉移癌的演進過程，都扮演極重要的角色，研究MMP可瞭解腫瘤的發生，並可研究開發出抑制MMP作用的藥物來治療癌症。

一．2 簡介

    基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases ，MMPs) 是可分解細胞外基質(extracellular matrix,ECM) 蛋白的酵素, 不管在正常或有病的細胞中, 他們都扮演重要的角色。蛋白質水解酶（proteases）在許多疾病中扮演重要的角色，細胞外蛋白質水解酶是腫瘤細胞穿過組織細胞所須的物質, 水解ECM蛋白對侵掠性腫瘤的轉移（metastasis）是必須的;此外, 支援腫瘤生長的血管增生也借著侵略表皮細胞來水解ECM蛋白。有四種內月太 酶（endopeptidases）: 絲氨酸（serine）蛋白酶、胱氨酸（cystine）蛋白酶、天門冬氨酸（aspartyl）蛋白酶，基質金屬蛋白酶，四種都和以上的腫瘤發生、傳移過程有關。而MMPs是腫瘤發生過程中四種蛋白質水解酶（proteases）最重要的一種,

    在1962年初, 從蚵蚪尾巴發現的間質性膠原酶（interstitial collagenases）是最先被描述和純化的MMP。MMP是一組鋅離子依賴性內肽酶，它們大小各異，底物不盡相同，但至少都含有信號肽、前肽和催化區3個結構域，酶催化區和前肽區具有高度保守性。現在已經發現多種MMPs，可粗略分為四型:

     一·Ⅰ型有三種膠原酶: 間質性膠原酶、嗜中性膠原蛋白酶（neutrophil collagenase）、膠原酶, 此三種都可分解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型纖維狀膠原質（ fibrillar collagens）。

     二·Ⅱ型包含兩種72kDa、92kDa的明膠酶（gelatinases）和金屬彈性蛋白酶（metalloelastase）, 兩種明膠酶可分解Ⅳ、Ⅴ型基底層（basal lamina）非纖維狀膠原質, 也可分解Ⅶ型的膠原質、纖維結合蛋白（fibronectin），Ⅹ型的短鏈膠原質、彈性蛋白和金屬蛋白酶。

     三·Ⅲ型有基質溶素-1（stromelysin-1）、基質溶素-2、matrilysin, 它們可分解Ⅳ型的膠原質和Ⅹ型膠原質中的蛋白多糖（proteoglycan）、纖維結合蛋白、laminin。

     四·mRNA 原位雜交（in situ hybridization） 證明基質溶素-3 對惡性疾病是很重要的, 它的蛋白水解功能已被描述。膜型基質金屬蛋白酶（membrane-type metalloproteinase，MT-MMP）已被發現,MT-MMP可結合於胞膜上是具有，MT-MMP是以特殊的活性明膠酶原A（activate progelatinase A ）出現。從最初的發現至今, 已有數個MT-MMP的基因被確定, 這些酵素都暫時歸於MMP的Ⅳ型。

    許多報導說明蛋白質水解酶在輔助基底細胞（adjuvant stromal cell）比在惡性侵略的細胞出現得多, 由此證明, 腫瘤細胞可在基質細胞附近引發製造蛋白質水解酶, 此概念說明引起腫瘤發生的因數會刺激正常細胞產生膠原酶、基質溶素、明膠酶 A。侵略性癌細胞增加它們的蛋白水解能力而非增加蛋白質水解酶的製造, 它們並可集中蛋白質水解酶作用于細胞外周, 由製造許多不同種的蛋白質水解酶, 它們可完全分解基質（matrix）。

MMP在腫瘤中的作用

     MMPs的分解能力跟酵素分泌時間和抑制劑有關, 抑制劑包括一般的血漿蛋白酶抑制劑, 像是a2-巨球蛋白, 還包括特殊的抑制劑, 如TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3。數種疾病, 如關節炎、硬化症、癌症都與酵素和抑制劑之間的不平衡有關, 這些不平衡使得細胞外基質分解。研究顯出, 癌症發展過程中MMP的作用力會大於抑制劑,MMP幫助第一級腫瘤的擴散和侵略, 幫助腫瘤細胞通過血管細胞壁, 和幫助第二期腫瘤的成長和侵略,MMP也使提供惡性腫瘤生長的血管增生。

     並非所有種類癌細胞都使用MMPs來分解基質, 其他種的蛋白水解酵素, 如尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因數已在惡性腫瘤中發現, 以基質金屬蛋白酶抑制劑（MMPIs）作為抗癌藥物的一大挑戰是要能確認癌細胞種類。

基質金屬蛋白酶

MMP排序

分子量

主要底物

Ⅰ型

 

 

 

    間質性膠原酶

1

57000

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型纖維性膠原

    嗜中性膠原酶

8

75000

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型纖維性膠原

    膠原酶

13

54000

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型纖維性膠原

Ⅱ型

 

 

 

    明膠酶A

2

72000

Ⅳ、Ⅴ型膠原，明膠原

    明膠酶B

9

92000

Ⅳ、Ⅴ型膠原，明膠原

    金屬彈性蛋白酶

12

52000

彈性蛋白

Ⅲ型

 

 

 

    基質溶素-1

3

58000

Laminin，纖維結合蛋白，黏蛋白

    基質溶素-2

10

58000

Laminin，纖維結合蛋白，黏蛋白

    Matrilysin

7

28000

Laminin，纖維結合蛋白，黏蛋白

Ⅳ型

 

 

 

    基質溶素-3

11

29000

α-1抗胰蛋白酶

    Ⅰ型膜型MMP

14

66000

明膠酶原A

    Ⅱ型膜型MMP

未定

76000

未知

    Ⅲ型膜型MMP

未定

70000

未知

    Ⅳ型膜型MMP

未定

未知

未知

表一  MMP分類

 

膠原酶

         口腔和喉部表皮腫瘤的纖維狀膠原酶活性是增加的，纖維狀膠原酶活性的高作用力也在胃腫瘤被發現。在結腸癌中溶膠原活性和組織學等級不同之處被偵測出來。

基質溶素

    高度的基質溶素-1 的mRNA編碼已在肺、頭頸部的癌症中發現, 它並不存在於前列腺癌、胃癌、結腸癌；相反地, 高度地PUMP-1 mRNA表達在胃癌和結腸癌中,後者位於腫瘤組織或附近正常組織沒表達的基質中, 在前列腺癌中, 惡性和非惡性表皮細胞都有高度表達, 卻沒在相關的基質中找到。

明膠酶

    潛伏的明膠酶A 會有效地在惡性乳癌中增加, 並且有活性酵素比例隨腫瘤等級增加, 此證明有活性的明膠酶A 大量存在侵略性乳癌中。明膠酶A 的表達和胃癌、結腸癌和乳癌發展有關。明膠酶A 比起良性卵巢囊腺瘤（cystadenomas）, 它在侵略性卵巢腫瘤找到較多；比較正常血清它在肺癌病人的血清較多, 並且比較無轉移情形的病人, 有轉移情形的病人找到較多。在non-small cell肺癌和matched non-involved肺組織中,明膠酶A 表達層次和腫瘤擴散的組織病理學有高度相關性。明膠酶A 也位於結腸癌和滲透扁平皮膚癌細胞相關的基質兩者中。後來研究明膠酶B mRNA表達, 它位在扁平細胞癌腫瘤和基質兩者之間, 也在組織巨嗜細胞亞群被偵測出來。

基質溶素-3

    只有少量基質溶素-3 mRNA在結腸、卵巢、腎、肺癌被偵測出來, 運用原位雜交和免疫組織化學進行組織定位，matrilysin和基質溶素-3的研究結果較一致，前者僅在癌細胞和異型增生的上皮細胞中表達，間質細胞不表達，而後者只在間質中表達。  

基質金屬蛋白酶抑制劑

    天然或合成的抑制劑都可用來治療癌症, 然而, 使用天然的抑制劑TIMP-1、TIMP-2會有口服上的限制, 他們的大小28kDa、21kDa對組織的穿透力有所限制, 合成或重組TIMP的功能區是較有效的方法。從80年代初期開始發展合成MMPIs, 這些抑制劑是多月太   衍生物, 為膠原質分子金屬結合基的類似物, 金屬結合基結合MMP上活化位置的鋅原子, 微莫耳就有作用。MMP抑制劑具有細胞穩定劑的作用，由此，同傳統的細胞毒性藥物聯合使用，可以更加有效地殺死瘤細胞，防止單獨使用細胞毒性藥物易引起的耐藥和反彈現象。

一．3 材料與方法

一．3-1 材料

1.蛋白來源—中國科學院上海藥物所

  ⑴菌株：JM109DE3

  ⑵質粒：PGEMEST

  ⑶底物（substrate）：thiopeptide H7145（Bachem company USA Bachem bioscience）

2.溶液

  ⑴LB培養液：tryptone 10g，yeast extract 5g，NaCl 10g，ddH20 100ml

⑵Lysis buffer：25mmol/L Tris·HCl pH7.6，150mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA，0.5％β-ME，200μg/ml Lysozyme，10％ glcerol

⑶Washing bufferⅠ：25mmol/L Tris·HCl pH7.6，150mmol/L NaCl， 0.5％β-ME，5mmol/L EDTA，0.25mol/L Urea，0.1％ TritonX-100

⑷Washing bufferⅡ：25mmol/L Tris·HCl pH7.6

⑸Denatured buffer：6M GdnHCl（鹽酸胍）

⑹Refolding buffer：50mmol/L Tris·HCl pH7.6，10mmol/L CaCl2， 0.1mmol/L Zn(Ac)2

⑺Equilibrated buffer：50mmol/L Tris·HCl pH7.6，10mmol/L CaCl2， 0.1mmol/L Zn(Ac)2

⑻Eluted buffer：50mmol/L Tris·HCl pH7.6，10mmol/L CaCl2， 0.1mmol/L Zn(Ac)2，1mol/L NaCl

一．3-2 方法

1. 20ml LB液中加入100μg/ml Ampr 和菌種，在37℃、200rmp搖晃下培養

2. 取含菌LB液10ml加入1000ml LB液中，再加入100μg/ml Ampr ，37℃、

   200rmp搖晃培養

3. 數小時後加入1mmol/L IPTG誘導劑使蛋白表達，37℃搖晃培養過夜

4. 12500rpm，15min，4℃離心，取沈澱

5. 沈澱物用Lysis buffer洗滌，400W超聲裂解（每次4秒停6秒）共100次，離

   心取沈澱

6. 用Washing bufferⅠ 800ml超聲裂解，離心，取沈澱

7. 用Washing bufferⅠ 80ml超聲裂解，離心，取沈澱

8. 用Washing bufferⅡ 600ml超聲裂解，離心，取沈澱

9. 用Washing bufferⅡ 60ml超聲裂解，離心，取沈澱

10.用Denatured buffer洗滌沈澱，離心，取上清液

11.在4℃環境下緩慢加入Refolding buffer後離心，取上清液，用底物測活性（確定是否蛋白折疊正確）

12.過Q-Sepharose柱子

 

一．4 結果與討論

 先用Equilibrated buffer清洗Q-Sepharose和蛋白純化儀（AKAT explore，Pharmaica），將蛋白液連續上樣，MMP-3會直接流過柱子，其餘蛋白被介質吸附，藉以達成蛋白純化分離。上樣完後，用Eluted buffer以增加鹽梯度方法來洗滌柱子，使雜蛋白被洗脫下來。

 圖一中F2的範圍是MMP-3 refolded上樣，F2範圍裏有一高起達360mAU的峰（P），此峰應是MMP-3蛋白。可用底物檢測流出的樣品，看是否有活性，另外也可跑蛋白電泳，確定P峰內無其他雜蛋白，若有雜蛋白，則要過另一柱子或分子篩。圖一中綠色的線表鹽濃度，從＂8＂之後開始增加鹽濃度，當鹽濃度達100％，吸附在介質上的蛋白都被洗脫下來。

    用原核細菌表達大量蛋白，常會産生包涵體，形成無功能的蛋白多聚體，因此必須想辦法使蛋白重新折疊，恢復正常的解構和功能。MMP-3蛋白的表達正好是包涵體，純化過程中經refolding的步驟，不知折疊後是否成正確結構，可用底物測活性。若包涵體問題未被解決，極有可能對蛋白純化産生不良的影響。

圖一   Q-Sepharose Chromatography of MMP-3 refolded