前言:

          八角蓮（Podophyllum pleiantbum (Hance)Woodson)屬於小櫱科
       (Berberidaceae)(圖一)，全世界已知品種有七種，臺灣只有本種,
       自生於海拔300-2500m，林下陰涼濕度較高處，富含落葉之腐植
       質土壤，本省山地野生地區，北部七星山、太平山、中部霧社、
       溪頭等地林下陰涼處

　　      臺灣環境因高度開發，八角蓮已幾乎被採掘殆盡，只剩東部
      山區和高海拔地區可見其芳蹤，且天然的結果率低，果實種子數
      少，發芽率低且不整齊 幼苗生長速度慢，因此甚少用種子繁殖，
      一般栽培方法都利用地下根莖分株繁殖(邱，1973) ，用植物組織
      培養方法，藉由擬胚的產生，誘導它發育成植株，以此保育臺灣
      稀有藥用植物。大量化癒合組織的建立，提供足夠的材料，用於
      鬼臼毒素的萃取和藥理研究。


目的:
        1. 種源保育，利用植物癒合組織的培養，產生癒合組織和體胚，
           誘導體胚發育成植株，得到大量的栽培苗，不再採掘於野生的
       
        2.懸浮培養使細胞大量化，探討二次代謝產物的產率，
          Podophyllotoxin(鬼臼毒素)具有抗癌作用，其藥理為抑制細胞
          分裂於中期,改良的鬼臼毒素: Teniposide(圖三)和Etoposid,
          藉由抑制第二型DNA拓樸異構酵素的正常運作，而毀滅癌細胞。


材料與方法:

       1.材料:
         取打破休眠的小苗,休眠芽外有鞘葉包裹，不易受微生物污
         染且消毒容易，休眠芽已具幼嫩的葉柄、葉之器官，幼嫩的
         組織易於誘導癒合組織的產生。
         取幼嫩的小苗，當小苗的幼葉伸展開後，剪下幼嫩的莖和葉，
         當作培植體用於植物組織培養。

       2.基本培養基:
         誘導癒合組織以MS培養基（Murashige and Skoog 1962，
         附錄A）為主,含有基礎鹽類及有機成份，sucrose 3%，agar
         (SIGMA)0.6%，調整pH=5.70。
         MSC由MS培養基之基礎鹽類及有機成份加上10%椰子汁(CW)， 
         調整pH=5.70。

生長調節劑:
       1.誘導癒合組織用2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)
         或 naphthaleneacetic acid(NAA)。濃度為0-2ppm。

       2.再生植株用gibberellic acid(GA3)和
         6-benzylaminopurine(BA)各1ppm。

培養條件:
         光照16hr，黑暗8hr，光強度1300Lux，培養溫度+/-26oC
         培養過程以解剖顯微鏡觀察，並作照相記錄。
      
消毒方式
 
       1.前處理:
         以大量清水洗淨，除去泥沙和污垢，泡殺菌劑(速大多)稀釋
         1000倍 浸泡1天。

       2.消毒:
         以大量清水洗淨後，以75%酒精擦拭培植體，加入2%的NaOCl
         (CLOROX)和TWEEN-20(SIGMA)數滴，用超音波振盪10min，
         再以手搖動5min，然後用無菌水洗滌三次，讓培植體上無殘
         留泡沫。

討論:

      1. 減少幼葉的污染，須注意葉片與葉片間的遮蔽作用，而減少
         葉片與消毒劑作用的時間和接觸面積，避免此種作用的方法，
         將葉片事先剪成適當的大小，放入消毒瓶中，葉片的量不要
         太多，消毒時，注意消毒的時間是否太長，若時間太長，葉
         片會有被消毒劑侵蝕的現象，培養時，反應會不良。

 
      2. 成熟的葉柄和葉片，無論用何種生長調節劑種類和濃度變化，
         雖然培植體未褐化前，裂痕中會有癒合組織增生的情形，但培
         養時間一久，培植體就會褐化，無法有效促使癒合組織增生，
         幼嫩的葉柄和葉片，培養於NAA或2,4-D濃度0.1-2ppm皆能產生
         癒合組織，長時間培養不易褐化，所以幼嫩的葉柄和葉片適合
         癒合組織誘導。

      3. 生長調節劑的濃度，以低濃度0.1-1ppm培植體呈現淺綠色，較
         易有體胚的產生，生長調節劑的濃度2ppm長期培養癒合組織顏
         色易轉深，體胚的發生率低，所以要使癒合組織發育成體胚，
         須降低生長調節劑的濃度。

      4. 含有椰子汁的培養基，培植體的反應較優良，不易有酚類的產
         生，成熟的葉柄和葉片長期培養最明顯，幼嫩的葉柄和葉片癒
         合組織發育成擬胚的機率較高，可能原因為椰子汁含有複雜的
         成份和必要的有機物，能提供培植體必要的營養，所以培植體
         生長較好。

      5. 前人研究顯示(莊，1986)，葉柄的癒合組織培養MS-medium含
         BA和GA3各1ppm中，會有芽的發育，在本實驗中，用相同的方
         法與培養基，得到的結果是根的發育，可能原因:與前人所取
         培植體的發育階段不同，所以在BA/GA3的培基而有不同的發育
         情況；或是培養癒合組織的時間長短不同，移到含BA/GA3的培
         基而有不同的發育情況。

參考文獻