ssh10b

二．1 摘要

染色體DNA可和DNA結合蛋白形成一定的結構，真核生物、細菌和常溫古菌的DNA均爲負超螺旋，有些DNA結合蛋白可固定（constrain）DNA的負超螺旋結構，極端嗜熱古菌（Hyperthermophilic Archaeon）Sulfolbus shibatae 中的Ssh10b 蛋白固定DNA負超螺旋的能力會隨溫度而不同。經由Ssh10b蛋白的結晶、衍射，瞭解到長晶體的基本流程。

二．2 Ssh10b簡介

在真核生物中，染色體DNA負超螺旋結構被組蛋白所固定，細菌染色體DNA負超螺旋結構被類組蛋白（HU，HD，NS1，NS2 or DNA binding protein Ⅱ）固定；真核生物和細菌染色體未被蛋白結合的區域可分爲鬆弛與不完全鬆弛狀態，嗜熱古菌染色體DNA大部份爲鬆弛狀態，但它與DNA結合蛋白作用卻可使DNA裸露區呈超螺旋狀態。極端嗜熱古菌已經找出多種分子量爲7、8、10kDa的DNA結合蛋白，Ssh10b爲Sac10b蛋白家族的一員，根據資料顯示，Sac10b以雙聚體存在溶液中，比7kDa、8kDa DNA結合蛋白有更強的DNA結合力。Ssh10b分子量約爲10.5kDa，有97個氨基酸，等電點11左右，它在S.shibatae所有蛋白含量約占4％，與DNA上約12bp相結合。電子顯微鏡顯示，在不同的蛋白濃度下會形成不同的DNA-蛋白複合體。25℃時Ssh10b固定DNA超負螺旋的能力是微弱的，45℃到80℃溫度之間它固定超負螺旋的能力大大增加，所以Ssh10b對嗜熱古菌適應環境溫度有極大影響。根據DNA拓撲學原理，DNA結合蛋白固定超螺旋的方法是使DNA纏繞DNA結合蛋白多聚體表面或改變DNA每圈螺旋的鹼基對數，或同時産生兩種變化。

二．3 蛋白結晶基本原理

分子在溶液中結晶爲一種平衡狀態，迫使分子結晶的動力和動力學體系相同，即是使自由能達到最小，此時吸引作用--電的、空間的、疏水的、親水的作用達到最大，而分散或排斥力減至最小。對於生物大分子，通常它們達到完全溶劑化時，才達到自由能最小。濃溶液中，沒有足夠的水維持完全溶劑化（或說使大分子相互之間隔開），大分子因此沈澱或結晶。聚集作用過快，往往産生非晶態沈澱，一般來說，應使不完全溶劑化過程儘量減慢，讓分子有機會把自己排列到晶格中。大分子會因其形狀、多價特性和物理性質，及溶液濃度、pH、溫度等因素影響下，大分子會有不同的最小溶解度。大分子結晶的方法，是讓溶液體系非常緩慢趨向溶解度最小，進而達成過飽和狀態。

二．4 材料與方法

Ssh10b蛋白來源爲中國科學院微生物所，此蛋白會跟DNA結合，純化過程中必須分離DNA，純化過程中除了用蛋白電泳檢查雜蛋白外，另外還須跑DNA電泳來確信Ssh10b已經和DNA分開。

懸滴氣相擴散法是一簡便的方法，它非常適用於少量材料又要大量篩選的情形，此法是使任何揮發性的組分在小液滴和大樣品池液間達成平衡狀態，使蛋白質液滴中沈澱劑及蛋白質的濃度逐漸增加, 達到過飽和狀態, 最終析出晶體。懸滴氣相擴散法的基本步驟：

1. 將多孔組培養板、蓋玻片上的灰塵吹走，儘量減少成核中心的數量，避免影響到蛋白晶體的形成

2. 純化後的Ssh10b蛋白濃縮到15mg/ml，取2μl蛋白液滴在矽化過的玻片上，加入等體積的池液。另外可滴另一滴池液在玻片上，作爲對照

3. 將玻片蓋在塗有真空脂，壓緊，使多孔組培養板的小孔密封，讓小孔中充滿揮發性的組分

4. 觀察各個小孔內蛋白液有無變化，置於恒溫環境（晶體生長室的溫度爲18℃），每隔數天觀察一次作紀錄

二．5 結果與討論

Ssh10b蛋白用 Crystal screen ＆ Crystal screen 2 （ Hamptom company ）試劑來篩選晶體生長條件，蛋白濃縮液滴入池液後數分鐘，KitⅠ-45孔中已經長出晶體，三星期後再次觀察，多孔內都長出晶體（見圖二、三、四、五、六、七）

圖二用KitⅠ-10〔30％ PEG400，01.M Na acetate pH4.6，0.2M Ammonium Acetate〕試劑長出的晶體，晶體形狀爲不均一長柱形，顔色較深的球狀物應爲沈澱物

圖三用KitⅠ-36〔8％ PEG8000，0.1M Tris·HCl pH8.5〕試劑長出的晶體，數顆長柱狀大晶體，此晶體似乎容易受環境影響，從圖中可見到晶體斷裂成兩段，而且表面有缺刻

圖四用KitⅠ-41〔10％ iso-propanol，0.1M Na Hepes pH7.5，20％PEG4000〕試劑長出的晶體，圖中是均一性長柱狀小晶體，量多

圖五用KitⅠ-45〔18％ PEG8000，0.1M Na Cacodylate pH6.5，0.2M ZincAcetate〕試劑長出的晶體，均一性長柱狀數個大晶體

圖六用KitⅠ-50〔15％ PEG8000，0.5M Lithium Sulfate〕試劑長出的晶體，菱柱狀晶體，數量較KitⅠ-45內的晶體多，照此張相片時，懸滴液有分相的情形，晶體似乎也受到影響，晶體棱角變的不明顯

圖七用KitⅡ-1〔10％ PEG6000，2.0M Sodium Chloride〕試劑長出的晶體，均一性低的三角柱小晶體，量多

長出晶體後必須繼續優化晶體生長條件，可以在長出晶體的Kit試劑裏選出較好的條件，例如：KitⅠ-45、KitⅠ-50，以梯度改變的方法在這些試劑條件附近配製不同的池液，可以改變鹽濃度、PEG濃度…等，找出最適合晶體生長的條件；有大的、均一性高的單晶（不能是孿晶或聚合晶），才有好的晶體X光衍射資料，才能解出正確的結構。KitⅠ-45、KitⅠ-50條件下長出的晶體拿去衍射，防凍液的配製也很重要，像KitⅠ-50晶體使用葡萄糖的防凍液之後，才得到比用甘油作防凍液更好的資料。

總結

Ssh10b比起MMP蛋白實在幸運的多，第一次長晶體就得到基本資料，MMP蛋白純化之後似乎沒問題，但將濃縮的蛋白液拿去長晶體，往往長出鹽晶體，一來可能是表達、純化的問題，二來可能是晶體生長條件不對；表達量方面，據中國科學院上海藥物所人員表示，可能是因爲北京、上海兩處實驗環境條件不同，例如：菌種新鮮程度；純化方面，很有可能是對包涵體處理技術尚未突破，今後仍要對純化步驟多加改進，並找出適合MMP 生長的晶體條件。

衍射資料的收集受到許多條件的影響，例如：晶體生長條件（蛋白純度、溫度、池液成份）、防凍劑，Ssh10b晶體必定朝改善生長條件的目標進行，並且要進一步作出Ssh10b和DNA的複合物，瞭解Ssh10b和DNA之間相互作用的關係。