工作一、Construction of PCEP4(-EBNA)-SRp20HA
工作二、Construction of PCEP4(-EBNA)-9G8HA
Background：
在真核細胞中，訊息核酸先驅分子之剪接是基因表現的重要步驟之一。以前許多人的研究已發現
SR protein不僅為必要之剪接分子，亦為調節另類剪接之重要因子。SR protein分子有一特殊的
domain即為(arginine/serine) 多次重複的RS domain。最近，RS domain 被發現在一些未知功能
的新型蛋白分子上，由於這些分子會與轉錄因子有交互作用，因此它們可能會扮演連接與協調轉錄
與核酸剪接之功能。
由於 SR protein為重要之剪接分子，因此我們對於這類分子如何被運送至細胞核也有很大的興趣。
譚琬玉老師的實驗室最近發現了一個新的 importin-b 家族蛋白分子，並稱其為 transportin-SR
(TRN-SR)。他們發現 TRN-SR 只會辨識經過磷酸化的 SR protein，而且它的 Ran-binding
deficient mutant 會與 SR protein同時存在於細胞核的 speckle 中，此結果顯示 TRN-SR 可能
在運送磷酸化之 SR protein進入細胞核之過程中扮演重要之角色。
目的：
我們已經從分生課本中得知SR protein和mRNA splicing有關，而SRp20和9G8為SR protein的一種。
照學長所言，當SRp55(也是一種SR protein)以轉錄抑制劑DRB處理後會發生hyperphosphorylation
的現象，我們想知道是否其他的SR protein也會如此，所以此二工作主要是製備SRp20和9G8，藉此
觀察是否同為SR protein的SRp20和9 G8也有此hyperphosphorylation的現象。
工作一實驗流程：
sequence of SRp20 (a)(b) sequence of pcep4
insert: vector:
Running PCR(use primer)
Phosphorylation
Cut SalⅠ Cut PvuⅡ、XhoⅠ
CIP
Ligation
Transform
挑菌、養菌，抽其plasmid DNA作測試，並切切看是否正確
抽kit，確認無誤後送sequence
工作二實驗流程：
sequence of 9G8 (a)(b) sequence of pcep4
insert: vector:
RT(use total RNA)
Running PCR(use primer)
Cut HindⅢ、XhoⅠ Cut HindⅢ、XhoⅠ
CIP
Ligation
Transform
挑菌、養菌，抽其plasmid DNA作測試，並切切看是否正確
抽kit，確認無誤後送sequence
工作一二實驗結果：
共各約transform了十五次，尚未成功挑到正確的菌。
前幾次長不出來，後來每盤約略長六個左右，但抽出之plasmid很怪，size大約為3k，介在insert
(500和750 base pair)與vector(6k)間
SRp20 實驗組colony數 control組(僅有vector無insert)colony數 正確菌數
1 1 0 0
2 11 10 0
3 0 0 0
4(電擊) 0 0 0
5(電擊) 0 0 0
6 1 0 0
7 5 1 0
8 9 2 0
9 12 4 0
10 4 1 0
11 1 4 0
12 2 3 0
13 3 3 0
14 6 4 0
9G8 實驗組colony數 control組(僅有vector無insert)colony數 正確菌數
1 9 8 0
2 3 2 0
3 1 0 0
4 3 2 0
5 0 0 0
6(電擊) 0 0 0
7(電擊) 0 0 0
8 0 0 0
9 3 11 0
10 2 3 0
11 17 9 0
12 6 6 0
13 6 0 0
14 6 0 0
15 6 4 0
討論：
1、 技術有問題?????
剛開始會覺得是否自己哪地方遺漏使前置prepare DNA的部分沒做好，但詳細check又反反覆覆重新
prepare了很多次依然結果一樣，且學長姐幫我們做也是一樣，故不是技術上之問題
2、 ligase有問題????
我們向其他三個實驗室借了ligase各作了一次，結果依然一樣，後來實驗室裡的ligase重新又定了，
結果還是不變，故不是ligase的問題
3、 Competent cell 本身有vector，且抗Amp?????
直接拿Competent cell去塗Amp plate，不會長，故沒問題,並且我們把competent cell拿來養,抽抽
看是否有plasmid,沒有抽到東西,確定competent cell本身沒有vector
4、 Competent cell effectivity不好????
拿先前學長姐construction好了的vector來transform，長滿滿的，故知Competent cell effectivity
沒問題，不過我們來是又重新製備了一批新的，確定沒問題
5、 Plate Amp沒作用????
拿學長給的有抗Amp的菌塗，會長，拿不抗Amp的塗，不會長，可知plate和Amp沒問題
6、此vector真的長的這麼少???
我們在無計可施的情況下使用最後的方法----電擊,但居然一個colony都沒長.........
到最後依然不知究竟哪裡出了問題???????