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首先將protein上的N-glycan分離下來,標定上螢光物質後,再用 |
HPLC依照charges和size分離,最後用Mass
spectrum來鑑定。 |
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A.
Release N-glycan from fetuin. |
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1. |
用trypsin和chymotrypsin來打斷所有的雙硫鍵,可使被protein包著的glycan露出。用量約為protein的1/50。水浴37℃,過夜。 |
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2. |
再用C18
Sep-Pak分離雜質。 |
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3. |
加入約3μl的PNGF,水浴37℃,過夜。 |
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4. |
再用C18
Sep-Pak分離出切下來的N-glycan。 |
B.
Fluorescence labeling with anthanilic acid (AA). |
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1. |
準備反應溶液: 4%
sodium acetate.3H2O、2%
boric acid (w/v) in MeOH。 |
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2. |
準備AA反應溶液:
30mg的anthranilic
acid和20~30mg的cyanoborohydride,一起溶在1.0ml上述的反應溶液中。 |
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3. |
將N-glycan
(<3nmol in
20~50μl of water)與0.1ml上述AA反應溶液混合均勻。 |
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4. |
置於80℃的烘箱中約60分鐘。 |
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5. |
用nylon
syringe filter disks (0.45μm,
25mm dia)來分離已標定的N-glycan和剩餘的AA反應物。 |
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6. |
用speed
vac.抽乾。 |
C.
Fluorescence labeling with 2-aminobenzoic acid (2-AB). |
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1. |
準備反應溶液: DMSO:AcOH=7:3 |
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2. |
準備2-AB反應溶液:
47.67mg的2-aminobenzoic
acid 和 62.84mg
的cyanoborohydride,一起溶於1.0ml上述反應溶液中。 |
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3. |
將N-glycan與5μl上述2-AB反應溶液混合均勻。 |
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4. |
置於65℃的烘箱中,2個小時。 |
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5. |
用GCS
(GlycoClean S Cleanup Cartridges)來分離已標定的N-glycan和剩餘的2-AB反應物。 |
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6. |
用speed
vac.抽乾。 |
D.
Conditions of NP (normal phase) HPLC analysis by charges. |
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1. |
For
Fetuin labeled with AA. |
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COLUMN:
PALPAK Type N (250mm,
4.6mm dia)
Buffer A: 2% AcOH、1%
tertrahydrofuran in Acetonitrile
Buffer B: 5% AcOH、1%
tertrahydrofuran、3%
triethylamine in water
Flow Rate: 1.0ml/min
Fluorescence: Ex.230nm/Em.425nm |
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2. |
For
Fetuin labeled with 2-AB. |
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COLUMN:
PALPAK Type N (250mm,
4.6mm dia)
Buffer A: 500mM
ammonium formate, pH=4.5
Buffer B: H2O
Flow Rate: 1.0ml/min
Fluorescence: Ex.330nm/Em.420nm |
E.
Mass analysis. |
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我們使用MALDI
Mass為主要的分析,其次是ES Mass。 |