Materials and Methods

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首先將protein上的N-glycan分離下來,標定上螢光物質後,再用
HPLC依照chargessize分離,最後用Mass spectrum來鑑定。
 
A. Release N-glycan from fetuin.
  1. trypsinchymotrypsin來打斷所有的雙硫鍵,可使被protein包著的glycan露出。用量約為protein1/50。水浴37℃,過夜。
  2. 再用C18 Sep-Pak分離雜質。
  3. 加入約3μlPNGF,水浴37℃,過夜。
  4. 再用C18 Sep-Pak分離出切下來的N-glycan
B. Fluorescence labeling with anthanilic acid (AA).
  1. 準備反應溶液: 4% sodium acetate.3H2O2% boric acid (w/v) in MeOH
  2. 準備AA反應溶液: 30mganthranilic acid和20~30mgcyanoborohydride,一起溶在1.0ml上述的反應溶液中。
  3. N-glycan (<3nmol in 20~50μl of water)與0.1ml上述AA反應溶液混合均勻。
  4. 置於80℃的烘箱中約60分鐘。
  5. nylon syringe filter disks (0.45μm, 25mm dia)來分離已標定的N-glycan和剩餘的AA反應物。
  6. speed vac.抽乾。
C. Fluorescence labeling with 2-aminobenzoic acid (2-AB).
  1. 準備反應溶液: DMSO:AcOH=7:3
  2. 準備2-AB反應溶液: 47.67mg2-aminobenzoic acid 62.84mg cyanoborohydride,一起溶於1.0ml上述反應溶液中。
  3. N-glycan5μl上述2-AB反應溶液混合均勻。
  4. 置於65℃的烘箱中,2個小時。
  5. GCS (GlycoClean S Cleanup Cartridges)來分離已標定的N-glycan和剩餘的2-AB反應物。
  6. speed vac.抽乾。
D. Conditions of NP (normal phase) HPLC analysis by charges.
  1. For Fetuin labeled with AA.
    COLUMN: PALPAK Type N (250mm, 4.6mm dia)
Buffer A: 2% AcOH、1% tertrahydrofuran in Acetonitrile
Buffer B: 5% AcOH、1% tertrahydrofuran、3% triethylamine in water
Flow Rate: 1.0ml/min
Fluorescence: Ex.230nm/Em.425nm
  2. For Fetuin labeled with 2-AB.
    COLUMN: PALPAK Type N (250mm, 4.6mm dia)
Buffer A: 500mM ammonium formate, pH=4.5
Buffer B: H2O
Flow Rate: 1.0ml/min
Fluorescence: Ex.330nm/Em.420nm
E. Mass analysis.
  我們使用MALDI Mass為主要的分析,其次是ES Mass


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