Experiment(1)

Procedure[1] Purification of 4T-2-C189 2001/7/18-19

我們將已經轉化質體的E.coli , 置於LB培養基(tryptophan 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, in water 1l)中用攝氏42度溫度誘發培養過夜, 取出液體以4000rpm, 攝氏4度12分鐘離心; 除去上清, 以Tris 10uM溶液溶解取出沉澱物。

經超聲波碎菌後,用12000rpm攝氏4度30分鐘離心,取出上清物作管柱層析。裝柱後先用Tris 25mM, NaOH 300mM, pH8.0洗沖液洗沖, 再來用imidazole/HCl 溶液作洗脫, 經吸收光譜分析可以推測蛋白質被洗脫到哪幾管, 在取出該些管子,以3500rpm離心,再以SDS-Page作純度測試。

Procedure[2] Preparation of 4T-2-C189 & HPO 2001/7/23-24

我們同時取載有4T-2-C189及HPO的質體(PGFX-4T-2-Jab), 加入菌液冰凍30分鐘,再用熱浴誘發, 控制溫度在攝氏37度讓細菌恢復; 最後用固體培養基加上指定抗體(卡那脢素)混和, 去篩選轉化成功的細菌。

載有HPO的質體PGFX-4T-2-Jab, 是採用GST gene fusion system的技術, 在目標蛋白HPO上面以fusion protein方式加上glutathione作為affinity binding recognition site, 用thrombin可以在管柱中切除之, 沖洗出原來的HPO蛋白。

Procedure[3] Purification of HPO 2001/7/25-26(過夜!)

上述的過程,我們已經有兩種E.coli分別表現兩種蛋白; 其中C189則是用來作為對照組或marker用。

經過procedure[1] 的過程到碎菌, 離心分離後取上清液, 使用小管柱式Glutathione Sepharose 4B affinity chromatography, 以pH7.4 PBS作沖洗液沖洗,再於攝氏16度環境將上清液注入,繼續以PBS洗沖, 以Coomassie Brilliant Blue檢測洗沖出的buffer中的蛋白質量。 洗淨後加入Thrombin封口搖勻, 再以PBS洗脫。洗脫出的蛋白用離子交換管柱層析分析, 發現有兩條picks, 經過SDS-Page檢查,發現始終有兩種蛋白的分子量。於是再用層析分離後離心脫水增高濃度養晶。

Procedure[4] Purification of HPO 2001/8/7-8(過夜!)

這次養菌過程, 改用攝氏37度培養, 經同樣的碎菌與離心分離過程, 由與上次純化的顏色比較, 推測有包涵體, 故作三次懸浮沉澱和10000g 離心, 尿素裂解後復性。再作affinity chromatography, 改以tris 20mM, NaCl 25mM, pH8.0溶液作洗沖。加入IDO與Thrombin後封口搖勻, 再洗脫。最後用SDS-Page分析純度, 再用管柱層析分離後養晶。

Notes

˙實驗用水

實驗室中一共有三種水供實驗用: 一是自來水, 二是去離子水, 三則是品質更高的超純水。第三種水是用來養晶用的水, 但是實驗室中也大量用來作涮洗SDS-Page玻板和容器;但是......絕對不可以用來配LB培養基！原因是即使作了配方,卻難保細菌仍然需要一些水中的雜質生存。(雖然比起來, 去離子水中又有什麼雜質也是令人懷疑......)我因為不知道, 第二週時就這樣配了LB培養基, 結果讓學長多花了一天才養出足夠量的細菌(還真的勒！)。

˙噬菌體危機

大量養菌的實驗室, 嚴防污染。在我進去後第四週, 實驗室爆發噬菌體污染, 所有養菌的培養基最後都不是出現混濁的液體(代表細菌)而是有漂浮物懸浮的澄清LB培養液; 危機連續一週不得解, 最後將所有大小三角瓶都送外消毒。

由於每次配培養基後, 一定先經過高溫壓力滅菌, 得到的結論是噬菌體似乎不怕一般實驗室的殺菌設備。

˙離子交換層析管

實驗室有人使用層析管不慎(絕對不是我, 因為我根本沒使用過層析管儀器), 在跑沖洗後沒有作處理, 讓管柱的液體跑光, 結果柱子灌氣出現氣泡,宣佈報廢。

所以實驗不是得到結果就了了, 實驗後的儀器處理, 才是實驗態度最重要的表現.像我常常負責幫忙離心, 結果定時十五分鐘, 時間到時自己也忘了, 然後給學長催後就忘了說把樣品取出後離心機要上蓋關好, 被訓了幾次。

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