Experiment(2)
Crystallization
經濃縮的蛋白, 我們用從Hampton Research公司購得的系統試劑作Crystal Screen,就是用系統裡頭五十二種配方, 分別和濃縮的純蛋白溶液以一比一的體積比融合; 及準備硅化過的蓋玻片, 進行Hanging Drop養晶程序:
我們實驗室是準備十六槽養晶盒, 用封口膠塗在圓筒狀槽的槽口邊緣如圖的橘色部分;槽內放screening用的溶液, 然後將混和的蛋白樣品用微pipetment在硅化的蓋玻片上滴出drop, drop朝下如圖般的蓋在槽口上並密封;注意上方和蛋白混和的溶液和下方槽內的溶液是一樣的。
通常在第三天觀察是否有晶體形成, 七天後再觀察一次。若有小晶種出現, 則將該晶種出現的screening buffer用不同的濃度調配,再作concentration gradient的screening。
在大陸, 我作最多的事就是擦蓋玻片。硅化程序就是把玻片插立在板子上, 放在抽真空瓶內加上二氯二甲基硅烷後封住抽真空, 大約一小時後取出玻片, 泡在酒精一片片拿出來把上面的油擦掉, 就像你一直用手指去壓眼鏡鏡片後再把它擦乾淨一樣, 只是蓋玻片有多薄啊? 每次養晶大約就可以消耗掉上百片玻片, 我們這些暑期來實習的人就是每天沒事就開始擦; 不小心還會擦破割手。硅化過玻片, 就會增加其表面張力, 液體在玻片上就會形成水珠而不會散成面狀。基本上也有公司在賣專門用來養晶的玻片, 就不需要這樣處理。不過我看目錄, 價格差太多了, 尤其是像這裡大規模的消耗所需要的花費。(一瓶二氯二甲基硅烷一百美金, 用了超過三年剛好我到實驗室才用完......)
p.s 大陸的『硅』就是我們所謂的『矽』。
不幸的是, 在大陸做兩次的HPO養晶, 都沒有晶體出現。
X-Ray Diffraction Analysis
X-Ray Diffraction是用撈圈(前端有微小圈圈的金屬絲)以表面張力抓持晶體, 在儀器中旋轉角度作phase調整的繞射分析。首先用撈圈撈晶體就是很累人的工作,
必須在顯微鏡下進行。然後撈圈撈到晶體後, 必須把撈圈安裝到以各種角度旋轉時, 撈圈中心點必須維持在原位才行。在photo 1的第三張照片中, X-Ray
繞射儀上的銀幕就是準心的顯示, 調整時會在銀幕上顯示十字狀的座標軸, 操作者必須手動的將撈圈調整到怎麼旋轉撈圈中心都在十字的交線處。
據學長所說, 這個工作"幸運的話", 可以在半小時內結束。
操作上, 則是將數據輸入電腦, 就可以自動化分析出data, 點狀的繞射投影圖就可以一張張的出來了。
Structure Computing
實驗室中配置兩台用來作結構分析的麥金塔電腦, 其軟體名稱我沒問......不過大致主要裡面有以下功能:
˙HKL: 繞射圖的指標化、修正晶體和收集器參數, 合併結果和相關比例因子,再參數修正, 選擇空間群等。目標是達到最終使用數據的最佳化。
˙CNS: 數據的相位計算與修正程式。
| MR | Phasing by Molecular Replacement |
| MIR/SIR | Phasing by Isomorphous Replacement |
| MAD | Multiple Anomalous Diffraction |
| SAD | Single Anomalous Diffraction |
˙SOLVE & RESOLVE: 從原始數據, 經MAD和MIR結構解析, 得到重原子位置與電子雲密度圖和其density modification。
˙O: 結構搭建與手工調整。
最後會得到和我們在RasMoc裡頭看到一樣的結構資料。他們實驗室有3-D眼鏡可以做立體影像的觀察。
往上: Experiment(1)